阿托伐他汀抗動脈粥樣硬化作用的實驗研究

藥紅梅,呂吉元

在臨床工作中,如何減少、避免冠心病事件的發生是目前心血管領域研究的熱點和難點,主要措施為去掉斑塊和穩定斑塊[1]。許多大型臨床試驗[2,3]表明他汀類藥物除了具有調脂、減少再狹窄外,還具有穩定粥樣斑塊、抑制血栓形成、恢復血管內皮細胞功能等作用。本研究旨在探討阿托伐他汀調脂及抗動脈粥樣硬化(AS)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 雄性Wistar大鼠(山西醫科大學生理教研室動物室),阿托伐他汀(ATO,商品名立普妥,每片20 mg,德國Godecke GmbH公司生產),VD3注射液(上海通用藥業股份有限公司),膽固醇(成都科龍化工試劑廠),豬膽鹽(北京奧博星生物技術有限責任公司),丙基硫氧嘧啶(上海復星朝暉藥業有限公司),HEPES緩沖液,血脂系列檢測試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司),丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所第一分所),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)放射免疫試劑盒(解放軍總醫院科技開發中心放免所),大鼠高敏C反應蛋白(hs-CRP)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)酶聯免疫吸附法(ELISA)測定試劑盒(美國BPB公司生產,大連范邦試劑公司分裝),NF-κ B p65單克隆抗體(Santa Cruze公司),PV-9000二步法免疫組化檢測試劑盒、濃縮型DAB顯色試劑盒及其余免疫組化相關試劑(北京中山金橋生物技術有限公司)。

1.2 動物分組 24只健康雄性 Wistar大鼠,體重 180 g～220 g,適應性喂養1周后,隨機分為兩組。對照組8只,飼喂正常飼料,動脈粥樣硬化模型組16只,飼喂高膽固醇飼料,并在飼養開始時,腹腔注射 VD 32 mL/kg(6×105 U/kg)。對照組則腹腔注射生理鹽水2 mL/kg。12周后模型建成。將建模成功的16只模型大鼠隨機分為模型組和藥物組,每組8只。藥物組大鼠給予10 mg/(kg?d)阿托伐他汀進行灌胃治療,對照組和模型組以蒸餾水灌胃,治療共持續8周。

1.3 觀察指標與方法 于治療前后分別測定大鼠血清血脂系列[總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、動脈粥樣硬化指數(AI)]、MDA、SOD、IL-6、TNF-α、hs-CRP、ox-LDL含量的變化情況,以及治療后心肌 NF-κ B的激活情況。血脂、MDA、SOD采用化學法測定;IL-6、TNF-α采用放射免疫法測定;hs-CRP、ox-LDL采用ELISA法測定;NF-κ B采用免疫組織化學法測定。

1.4 統計學處理 采用SPSS 10.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差(±s)表示,采用配對t檢驗和方差分析,P＜0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組治療前后血脂比較(見表1)

表1 各組治療前后血脂比較(±s)

表1 各組治療前后血脂比較(±s)

組別 n TC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL(mmol/L)LDL(mmol/L)AI對照組 治療前 8 1.63±0.19 0.65±0.16 0.30±0.04 1.01±0.26 4.45±0.86治療后 8 1.80±0.45 0.32±0.211) 0.27±0.09 1.21±0.27 7.17±3.72模型組 治療前 8 13.91±4.65 0.71±0.43 0.38±0.09 13.22±5.17 33.54±12.70治療后 8 10.53±5.07 0.42±0.23 0.40±0.12 9.56±5.45 27.90±4.30藥物組 治療前 8 13.56±5.32 0.62±0.32 0.33±0.12 12.63±4.56 54.89±15.60治療后 8 9.09±2.772) 0.29±0.151) 0.30±0.22 8.68±3.041) 32.01±16.731)與同組治療前比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01

2.2 各組治療前后各炎癥因子比較(見表2)

表2 各組治療前后炎癥因子比較(±s)

表2 各組治療前后炎癥因子比較(±s)

組別 n IL-6(pg/mL)TNF-α(ng/mL)hs-CRP(ng/dL)治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后對照組 8 47.18±17.61 49.02±18.50 1.36±0.20 1.59±0.37 51.27±20.60 53.83±26.39模型組 8 43.98±16.61 44.89±9.44 2.04±0.53 2.25±0.44 62.20±22.53 73.80±21.50藥物組 8 49.68±9.44 48.72±17.12 1.80±0.44 0.85±0.182) 56.67±23.23 49.56±28.501)與同組治療前比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01

2.3 各組治療前后M DA、SOD和ox-LDL比較(見表 3)各組治療前后 MDA、SOD均無統計學意義,但藥物組有降低MDA,升高SOD的趨勢。藥物組治療后ox-LDL水平顯著低于治療前(P＜0.05)。

表3 各組治療前后MDA、SOD和ox-LDL的比較(±s)

表3 各組治療前后MDA、SOD和ox-LDL的比較(±s)

組別 n MDA(nmol/mL)SOD(U/mL)ox-LDL(ng/dL)治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后對照組 8 4.39±1.82 3.75±1.56 140.85±4.82 139.76±3.84 35.67±12.13 46.30±5.91模型組 8 5.22±1.42 4.17±1.19 141.46±4.59 142.03±3.08 115.45±10.45 119.10±11.36藥物組 8 5.63±2.85 4.36±1.90 131.42±9.35 134.38±5.32 125.36±20.61 108.20±8.741)與同組治療前比較,1)P＜0.05

2.4 各組NF-κ B的免疫組化檢測結果 陰性對照是以PBS代替一抗所得的結果,可見核藍染,胞漿不著色。NF-κ B正常情況下處于失活狀態,存在于胞漿中,所以對照組可見藍染的胞核,并有黃色顆粒物分布于胞漿。當NF-κ B被激活時,就會由胞漿進入胞核,稱為核易位,在NF-κ B激活的陽性細胞中可見,胞核在藍色的基礎上著有棕色,呈現出深棕色,胞漿中黃色顆粒物減少。在本實驗中,每張切片隨機挑取3個視野,計數核易位的細胞數目,計算平均核易位率。NF-κ B核易位率:藥物組為(9.37±4.28)%,對照組為(5.02±3.33)%,模型組為(15.40±10.09)%。藥物組與對照組 NF-κ B核易位率明顯低于模型組(P＜0.01)。

3 討 論

他汀類藥物是近十幾年開發的三羥基三甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑,能有效地降低 LDL,提高HDL。經 4S[4]、CARE[5]、LIPID[2]、WOS[6]、AFCAPS/TexCAPS[7]等大型臨床實驗已證實其對冠心病的一級和二級預防作用。許多年以來,人們將他汀類藥物的藥效單一歸結于它的調脂作用。近來有研究發現除了調脂作用外,他汀類藥物還有其他的抗動脈粥樣硬化作用。

3.1 調脂作用 他汀類藥物的調脂作用有助于AS斑塊的形成,而它對內皮功能的改善、抑制平滑肌細胞的增殖和聚集、誘導平滑肌細胞的凋亡和抗炎等調脂外的作用不僅能減緩動脈粥樣硬化斑塊的形成,減小斑塊大小,還能穩定斑塊,阻止AS斑塊的進一步發展,對于臨床心血管事件的防治有重要意義。本研究結果顯示,藥物組明顯降低 AS大鼠的血清TC、TG、LDL含量,表明阿托伐他汀具有明顯的調節血脂作用。

3.2 抗炎作用 研究發現,他汀類藥物在內皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞中有潛在的抗炎和抗血栓作用,能抑制巨噬細胞因子的表達、NF-κ B的激活、對抗 ox-LDL誘導的一氧化氮合酶下調以及下調家族性高膽固醇血癥患者升高的血清可溶性CD40L(sCD40L)水平,對動脈壁具有獨立于降膽固醇外的保護作用[8]。本實驗發現,藥物組治療后血中hs-CRP、TNF-α水平以及心肌組織中的NF-κ B水平均明顯低于模型組,說明阿托伐他汀具有抑制炎癥細胞在血管壁的積聚及減輕粥樣斑塊炎癥的作用,阿托伐他汀抑制炎癥的作用是其消退斑塊、穩定斑塊及降低臨床心血管事件發生率的原因之一。

3.3 抗氧化作用 有研究表明,他汀類不但可以抑制LDL氧化,還可以減少巨噬細胞攝取LDL的能力[9]。有學者發現辛伐他汀、氟伐他汀可抑制ox-LDL的促鼠腹腔巨噬細胞生長作用。其他作者相繼證實他汀類藥物可抑制巨噬細胞產生超氧陰離子,減少ox-LDL的生成,抑制巨噬細胞表達清道夫受體及組織因子,減少ox-LDL的攝取[10,11]。本實驗結果表明,ATO組治療后ox-LDL治療后較治療前顯著降低,即阿托伐他汀也同樣具有降低ox-LDL的作用,從而抑制ox-LDL在AS發生發展過程中的作用,增強了斑塊的穩定性。本實驗同時檢測了血SOD活力和MDA含量。SOD活力反映了機體清除氧自由基的能力,MDA反映了機體受氧自由基損害的程度。結果表明阿托伐他汀治療前后比較差異無統計學意義,但有提高機體SOD活力降低MDA含量的趨勢。阿托伐他汀具有獨立于調脂外的抗炎、抗氧化等多方面的抗動脈粥樣硬化作用。

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