尼古丁對血管內皮細胞PAI-1表達水平的影響

杜 艷,韓葆芬,胡曉蕓

纖溶系統的功能下降與血栓性疾病密切相關,纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)是纖溶系統的一個重要調節因子,高水平的PAI-1抑制纖溶系統的活性,參與血栓性疾病的發生發展過程。尼古丁作為香煙煙霧中的有害物質之一,不僅可以活化炎性細胞,調控細胞凋亡,而且可以損傷血管內皮,導致內皮細胞功能障礙,是血栓形成的重要危險因素。本研究采用尼古丁干預人臍靜脈內皮細胞(HUVECs),觀察尼古丁對PAI-1在蛋白及基因水平表達的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑 HUVECs細胞株購自上海門諜塔生物科技發展有限公司。尼古丁購自美國Sigma公司;胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司;RPMI-1640培養基、胰蛋白酶均為美國Gibco公司產品。PAI-1酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海太陽生物技術公司;PCR引物由上海生工生物工程公司合成;T rizolRNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 HUVECs的培養與分組 HUVECs用含10%FBS的RPMI-1640培養液,在 37℃、5%CO2箱中培養,隔日換液 1次,待細胞生長至亞融合狀態時用0.25%胰蛋白酶消化液以1∶2傳代,接種于25 cm2培養瓶中,倒置顯微鏡下觀察可見細胞呈多角形或“鋪路石”樣排列,待 HUVECs達80%融合后隨機分為對照組與尼古丁組。對照組培養液中不加任何干預;尼古丁組于培養液中加入一定體積的尼古丁,使其終濃度為100 μ mol/L。相同實驗條件孵育12 h,收集各組細胞及上清液用于PAI-1mRNA及蛋白的檢測。

1.3 PAI-1蛋白的測定 采用ELISA法對各組細胞上清液進行測定。實驗操作嚴格按試劑盒說明步驟進行。

1.4 RT-PCR檢測PAI-1 mRNA表達 按 Triol試劑盒說明提取細胞總 RNA。按轉錄試劑盒取6 μ L的總RNA逆轉錄為相應的cDNA。再取逆轉錄產物5 μ L進行 PCR的擴增反應,PAI-1引物序列:上游5'-TGCCCTCTACTTCAACGG-3',下游5'-GTCGGTCATTCCCAGGTT-3',擴增產物片斷 390bp。GAPDH 引 物 序列:上 游 5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3',下游 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3',擴增產物片斷307bp。PCR循環條件:94℃預變性2 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸30 s,共反應32個循環。取PCR擴增產物10 μ L,在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳,用凝膠成像系統對電泳條帶進行吸光度(A)值的半定量分析。以PAI-1/GAPDH mRNA吸光度比值來表示PAI-1mRNA的表達水平。

1.5 統計學處理 經SPSS 13.0軟件包進行統計分析,數據以均數±標準差(±s)表示,采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HUVECs形態觀察 在倒置相差顯微鏡下觀察HUVECs,可見其形態不規則,呈扁平、橢圓形、梭形或多角形,為單層鵝卵石狀鑲嵌排列,細胞單層融合時呈典型的“鋪路石”樣外觀。

2.2 尼古丁對HUVECs PAI-1mRNA表達的影響 總RNA經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離可見28 s和18 s兩條清晰的條帶,表明RNA保持較好的分子完整性。PAI-1與GAPDH的PCR產物經電泳分離后,與Marker比較在100bp～500bp之間可見兩條分子量大小不同的特異性條帶,與預期長度相吻合,說明為特異性擴增片段,GAPDH產物光密度值基本一致(見圖1)。尼古丁組 PAI-1mRNA(1.321±0.198)顯著增高,與對照組(0.729±0.100)比較,差異有統計學意義(P＜0.01)。

圖1 尼古丁作用 HUVECs后PAI-1mRNA表達電泳圖

2.3 尼古丁對HUVECs PAI-1蛋白表達的影響 尼古丁組PAI-1蛋白表達與PAI-1 mRNA的變化一致,尼古丁組PAI-1蛋白為(21.084±0.829)ng/mL,對照組為(13.388±0.927)ng/mL,尼古丁組較對照組顯著升高(P＜0.01)。

3 討 論

正常血管內皮在維持凝血和纖溶系統功能上發揮重要作用,血管內皮的受損,導致凝血功能亢進,纖溶系統失活,與多種血栓性疾病的發生密切相關。大量的研究表明,吸煙是血栓性疾病發生的重要危險因素。香煙煙霧的主要有害成分尼古丁不但能引起炎性細胞的活化,調控細胞的凋亡,還能夠損傷血管內皮,導致內皮細胞功能紊亂,在血栓性疾病中起著關鍵作用。

PAI-1屬絲氨酸蛋白酶抑制物家族,是一種分子量約為50 kD的單鏈糖蛋白,是纖溶受損和血栓形成的標志物[1]。其功能為滅活組織型纖溶酶原活化物(t-PA)和尿激酶型纖溶酶原活化物(u-PA),從而對機體的纖溶系統活性起到重要的調節作用。PAI-1在纖溶系統中起著決定性作用,其活性和水平的高低決定著纖溶系統活性的高低。本實驗的前期研究表明,以不同濃度的尼古丁干預HUVECs后,各尼古丁組PAI-1含量均增高,但僅100 μ mol/L尼古丁組與對照組比較有統計學意義;再以100μ mol/L尼古丁干預HUVECs,分別孵育0 h、4 h、6 h、8 h、12 h和 24 h后,可見隨著時間的延長,上清液的PAI-1含量逐漸增高,并于12 h達到高峰,提示尼古丁在一定范圍內呈濃度和時間依賴性上調PAI-1的表達,對血管內皮的纖溶功能具有抑制作用,且引起變化的最佳尼古丁濃度是 100 μ mol/L,最佳作用時間是12 h。本實驗在此基礎上進一步對100 μ mol/L尼古丁作用于HUVECs12 h后的細胞PAI-1 mRNA進行檢測,結果顯示,尼古丁不僅可以引起HUVECs上清液中PAI-1蛋白的高表達,同時上調了PAI-1mRNA基因的轉錄水平,PAI-1蛋白和基因的表達一致,提示尼古丁在基因水平上誘導PAI-1的表達,進而調控蛋白的分泌,高水平的PAI-1引起t-PA/PAI-1mRNA和蛋白比值的下調而抑制了纖溶系統的活性。而多種炎癥因子如脂多糖、白細胞介素-1、腫瘤壞死因子、凝血酶和纖維蛋白原也可促進PAI-1的分泌[2,3]。作為對纖溶系統起決定作用的PAI-1,其在血漿中的水平及活性,既受許多環境因素的影響,又受機體遺傳基因決定,確切機制尚不清楚。近年來研究提示PAI-1基因啟動子區域轉錄起始點上游-675bp處,由于單個鳥嘌呤的插入或缺失形成了4個鳥嘌呤堿基序列(4G)或 5個鳥嘌呤堿基序列(5G)的多態性改變[4],可明顯影響PAI-1活性及水平[5]。

PAI-1基因4G/5G多態性與PAI-1的表達水平明顯相關:4G/4G基因型的PAI-1血漿活性水平最高,4G/5G基因型居中,5G/5G基因型最低。Brown等[6,7]也認為PAI-1(4G/4G)純合子的血漿PAI-1顯著升高,PAI-1基因型影響PAI-1的基礎濃度,也影響PAI-1受誘導后的濃度。

本研究結果表明尼古丁通過損傷血管內皮細胞導致PAI-1水平的升高,而PAI-1基因4G/5G的多態性與尼古丁誘發的PAI-1的高水平轉錄繼而導致血栓性疾病的發生是否呈正相關,這有待于進一步的實驗進行驗證。因此,深入研究PAI-1基因的多態性與血栓性疾病的關系,對進一步闡明尼古丁所致血栓性疾病的發病機制具有一定意義。

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