胃癌組織中HIF-1α、Bax、Bcl-2的表達及意義

吳 軍，張志廣，李 熳，盧向東，聞淑軍，齊鳳祥

（天津醫科大學第二醫院消化內科，天津 300211）

胃癌是我國常見的消化道腫瘤，其發生是一個多階段、多因素參與的發展過程。近年有研究顯示：腫瘤組織缺氧可以誘導產生缺氧誘導因子（HIF），而且它可能與胃癌的發病原因有關。而細胞凋亡與胃癌發生發展的關系也成為近年研究的熱點。缺氧能夠誘導腫瘤細胞凋亡，已在實驗研究中得到證實，而缺氧時HIF-1α蛋白的表達與細胞凋亡的關系尚有爭議。本研究應用免疫組化的方法檢測HIF-1α、Bax、Bcl-2在胃癌組織中的表達情況，并分析其與胃癌分化程度、浸潤范圍、淋巴結轉移的關系，探討胃癌組織中HIF-1α表達與細胞凋亡的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集天津醫科大學第二醫院及腫瘤醫院1999年1月~2003年12月手術切除經病理證實為胃癌的組織標本100例作為試驗組，其中男性79例，女性21例，年齡38~80歲，平均年齡61.1歲，所有病例手術前均未接受放療、化療或免疫治療。其中高/中分化40例，低分化60例，有淋巴結轉移52例，無淋巴結轉移48例，浸潤至肌層58例，浸潤全層至漿膜42例。對照組為天津醫科大學第二醫院消化科胃鏡下活檢經病理證實為慢性淺表性胃炎的組織標本20例。

1.2 檢測方法 兩組標本均經過石蠟包埋，切片后應用免疫組化（PV9000）染色法檢測100例胃癌組織，20例慢性淺表性胃炎組織 HIF-1α、Bax、Bcl-2的表達情況。鼠抗人HIF-1α單克隆抗體，鼠抗人Bax單克隆抗體，鼠抗人Bcl-2單克隆抗體，PV9000二步法免疫組化檢測試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照。

光學顯微鏡下觀察組織切片的顯色反應，選擇5個以上的高倍鏡視野（×200），不少于1000個細胞進行計數。HIF-1α的棕黃色顆粒主要分布于細胞核及細胞漿，結果判斷按照腫瘤細胞的染色比例分級，以伴或不伴細胞漿染色的細胞核染色為陽性計數標準[1]，未著色（-），核染色<1%（+），核染色 1%~10%伴或不伴細胞漿染色（++），核染色11%~50%伴或不伴細胞漿染色（+++），核染色>50%伴或不伴細胞漿染色（++++）,認定前3個等級為陰性表達,后2個等級為陽性表達。Bax、Bcl-2的棕黃色顆粒分布于細胞漿，結果判斷根據染色程度及染色細胞百分率進行評定，基本不著色為0分，著色淡為1分，著色深為2分。著色細胞占計數細胞的百分率：0~5%為0分，6%~25%為1分，26%~50%為2分，51%~75%為3分，76%~100%為4分，將每張切片染色程度與染色細胞百分率得分相乘的積為最后得分，0~1分為（-），2~3分為弱陽性(+)，4~6分為中等陽性（++），>6分為強陽性（+++），認定前1個等級為陰性表達，后3個等級為陽性表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行分析。兩樣本率的比較采用四格表資料的χ2檢驗，應用等級相關計數檢驗HIF-1α、Bax、Bcl-2三者之間的相關性。以P<0.05為檢驗水準，表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組與胃炎組HIF-1α、Bax、Bcl-2蛋白的表達情況 見表1。

表1 胃癌組與胃炎組HIF-1α、Bax、Bcl-2蛋白的表達[n（%）]

2.2 胃癌 HIF-1α(+)組與 HIF-1α(-)組 Bax、Bcl-2蛋白的表達情況 見表2。

表 2 胃癌 HIF-1α（+）組與 HIF-1α（-）組Bax、Bcl-2蛋白的表達[n（%）]

2.3 胃癌組HIF-1α與Bax、Bcl-2蛋白表達的相關性分析 胃癌組HIF-1α表達與Bax表達之間存在負相關關系（r=－0.510，P<0.05）；胃癌組 HIF-1α 表達與Bcl-2表達之間存在正相關關系（r=0.515，P<0.05）。

2.4 HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表達與胃癌分化程度及浸潤、轉移的關系 見表3。

表3 HIF-1α、Bax、Bcl-2蛋白表達與胃癌分化程度及浸潤、轉移的關系[n（%）]

3 討論

在實體腫瘤的發生過程中，由于血管生長的相對滯后和腫瘤細胞的快速增殖，導致腫瘤細胞缺氧[2]。而腫瘤細胞對低氧的適應導致一系列基因的轉錄，這些基因參與血管生成，鐵和糖的代謝及細胞增殖的過程。介導這一過程的首要因子即缺氧誘導因子（HIF），它包括構成性表達的亞單位HIF-1β和氧調節亞單位HIF-1α，后者的穩定性和活性受多種因素的調節[3]。HIF-1在實體腫瘤的生長和生存中起著重要的作用，HIF-1α的過表達現象已在人類許多腫瘤中發現[4]。Zhong等[5]對包括胃癌、胰腺癌在內的多種癌組織標本及人體正常組織分析發現，大多數人體正常組織中沒有或僅有弱陽性的HIF-1α表達，而癌組織中HIF-1α呈過表達。本研究發現，HIF-1α陽性表達率胃癌組織（56%）高于慢性淺表性胃炎組織（5%），二者之間的差異有統計學意義（P<0.05），提示HIF-1α過表達在胃癌的發生發展過程中可能起重要的作用。

近年來，人們認識到細胞凋亡同細胞增殖分化一樣，是維持細胞和組織平衡的重要機制。細胞凋亡異常是腫瘤形成的重要病理基礎，參與腫瘤發生發展的過程。凋亡相關蛋白Bcl-2家族在細胞凋亡的調控中起著極為重要的作用[6]，其中成員Bcl-2作為一種重要的凋亡抑制基因，而Bax是Bcl-2家族中第一個被確認為有細胞凋亡促進作用的成員，它不但可以拮抗Bcl-2的凋亡抑制作用，而且還可以直接促進細胞凋亡，在細胞凋亡過程中起著重要的樞紐作用。有研究顯示，在胃腺癌中Bcl-2蛋白高表達，而Bax蛋白低表達，這一現象提示抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax分別在胃癌發生中起到抑制凋亡與促進凋亡的作用[7]。本研究結果發現，胃癌組織中存在Bax蛋白的低表達，Bcl-2蛋白的高表達，提示胃癌組織中促凋亡因素減弱，而抗凋亡因素增強，細胞的增殖與凋亡平衡失調，可能參與胃癌發生發展的過程。

HIF-1α表達增加究竟是促進細胞凋亡還是抑制細胞凋亡尚有爭議。有的研究顯示，在人胃癌細胞系MKN-1中，HIF-1α表達與細胞增殖和凋亡相關，外源性上調胃癌組織中HIF-1α表達可通過增加抗凋亡蛋白表達，減少促凋亡蛋白表達，抑制細胞凋亡的發生[8]。而有的研究卻顯示，缺氧可以引起腫瘤細胞凋亡，即腫瘤細胞在適應了低氧環境的壓力，耐受缺氧后而誘導細胞凋亡的發生，這一過程的核心調節者為HIF-1α，它可以誘導高濃度的促凋亡蛋白而引發細胞凋亡[9]。鑒于上述研究結論的不一致，我們選擇了促凋亡蛋白Bax，抗凋亡蛋白Bcl-2來反映腫瘤細胞發生凋亡的情況，應用免疫組化染色法檢測HIF-1α、Bax、Bcl-2三者在胃癌組織中的表達情況并分析其相關性，結果顯示：HIF-1α蛋白的表達與Bax蛋白的表達之間存在負相關關系，而與Bcl-2蛋白的表達之間存在正相關關系，提示腫瘤缺氧產生的HIF-1α過表達可能通過降低促凋亡蛋白Bax的表達，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，抑制腫瘤細胞發生細胞凋亡。HIF-1α高表達減少Bax蛋白的表達，增加Bcl-2蛋白的表達提示HIF-1α的高表達有抑制細胞凋亡的效應，這與有的報道HIF-1α的高表達有促進細胞凋亡的效應結論不一致，原因考慮可能與選擇的凋亡相關蛋白不同有關，也可能HIF-1α高表達在不同的條件下有抑制細胞凋亡和促進細胞凋亡的雙重效應，有待進一步深入研究揭示HIF-1α的表達與細胞凋亡的關系。我們通過研究認為，HIF-1α表達增加可以抑制胃癌細胞發生凋亡，或許是HIF-1α參與胃癌發生發展過程的機制之一。

本研究結果顯示，HIF-1α蛋白在有淋巴結轉移組中的表達顯著高于無淋巴結轉移組的表達，在肌層浸潤組的陽性率顯著高于全層至漿膜浸潤組，這與崔寶紅等[10]的研究結論一致，提示HIF-1α蛋白與胃癌浸潤范圍及淋巴結轉移有關。Bax蛋白在高/中分化組中的表達顯著高于低分化組的表達，這與潘科等[11]的研究結論一致，在全層至漿膜浸潤組的陽性率顯著高于肌層浸潤組；而Bcl-2蛋白在高/中分化組中的表達顯著低于低分化組的表達，這與梁俊國等[12]的研究結論一致，在全層至漿膜浸潤組的陽性率顯著低于肌層浸潤組，提示Bax、Bcl-2蛋白與胃癌分化程度及浸潤范圍有關。可見，HIF-1α、Bax、Bcl-2蛋白表達與胃癌分化、浸潤、轉移密切相關。

［1］Chen WT，Huang CJ，Wu MT,et al,Hypoxia-inducible factor-1 is associated with risk of aggressive behavior and tumor angiogenesis in gastrointestinalstromaltumor[J].JpnJClinOncol，2005，35(4):207

［2］Parker C，Milosevic M，Toi A,et al,Paleographic electrode study of tumor oxygenation in clinically localized prostate cancer[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys，2004，58(3):750

［3］Ke Q ，Costa M.Hypoxia-inducible factor-1(HIF-1)[J].Mol Pharmacol,2006,70(5):1469

［4］Sasabe E，TatemotoY，Li D,et al.Mechanism of HIF-1α-dependent suppression of hypoxia-induced apoptosis in squamous cell carcinoma cells[J].Cancer Sci,2005,96(7):394

［5］Zhong H，De Marzo AM，Laughner E，et al.Overexpression of hypoxia-inducible factor-1α in common human cancers and their metastases[J].Cancer Res,1999,59(22):5830

［6］Aouacheria A.Novel genetic and peptide-based strategies targeting the Bcl-2 family,an update[J].Recent Pat DNA Gene Seq,2009,3(2):123

［7］Lee DS,Kang SB,Baek JT,et al,Immunohistochemical expression of bcl-2,bcl-XL,bax,p53 proteins in gastric adenoma and adenocarcinoma[J].Korean J Gastroenterol,2005,45(6):394

［8］Ardyanto TD,Osaki M,Nagahama Y,et al,Down-regulation of cobalt-induced HIF-1alpha expression correlates with cell proliferation and apoptosis in human gastric carcinoma cells[J].Oncol Rep，2008,19(2):339

［9］Greijer AE,Van der Wall E.The role of hypoxia inducible factor-1(HIF-1)in hypoxia induced apoptosis[J].J Clin Pathol,2004,57(10):1009

［10］崔寶紅，劉鐵夫，劉小川.HIF-1α在胃癌組織中的表達與臨床病理、P-gp、MRP1的關系 [J].哈爾濱醫科大學學報，2008，42（6）：616

［11］潘科，于敬達，劉麗娜.Caspase-9和Bax在胃癌組織中的表達及其意義 [J].包頭醫學院學報，2009，25（3）：11

［12］梁俊國，高旭東，朱憲明，等.Fas/FasL及Bcl-2在胃癌組織表達相關性及臨床意義 [J].內蒙古醫學院學報，2008，30（2）：80