檸檬提取物對變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶和細胞外多糖的影響

余志芬，張向宇，汪大照，郭卯丁

（天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院預(yù)防保健科，天津 300070）

變形鏈球菌 (streptococcus mutans,S.mutans)是目前公認的主要致齲菌，對牙面的黏附能力是其致齲的毒力因子之一，其在代謝過程中可產(chǎn)生葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferase，GTF)，該酶在細菌粘附到牙面上形成致齲性牙菌斑過程中起著重要的作用。近年來，國內(nèi)外的學(xué)者在天然藥物研究中發(fā)現(xiàn)，檸檬提取物(lemon peel extracts，LPE)有很強的生物學(xué)活性，其有效成分橙皮苷等具有較強的抗炎活性，能抑制細菌、真菌、病毒的生長和繁殖[1-5]，并且沒有組織蓄積性[6]。有研究表明，檸檬提取物稀釋51200倍仍可抑制變形鏈球菌在光滑玻璃表面的粘附[7]，但LPE的作用機制尚不明確，是否對GTF具有作用，且影響S.mutans胞外多糖的合成，即是否存在對粘附作用的另外一種機制—蔗糖依賴性粘附具有一定影響，國內(nèi)外報道不多。本研究通過檢測不同濃度LPE溶液對S.mutans在不同培養(yǎng)時間產(chǎn)生GTF和胞外水不溶性多糖(water insoluble glucan，WIG)及胞外水溶性多糖(water soluble glucan，WSG)合成能力的影響，探討LPE抑制S.mutans致齲力的作用機制，為齲病防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料 LPE，水提物，pH值為6.5，自行提純（未加任何溶劑、添加劑）；胰蛋白胨大豆肉湯（Trypticase Soy Broth,TSB,中國檢驗檢疫科學(xué)研究所）加入蒸餾水，配制成含2%蔗糖的TSB液體培養(yǎng)基，備用。

1.1.2 主要儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市實驗儀器廠）；LD5-28低速離心機（北京京立離心機有限公司）；三用水箱（北京醫(yī)療設(shè)備廠）；723-A光柵分光光度計（湖州麥克奧迪分析儀器有限公司）；QL-901旋渦振蕩器（江蘇海門其林醫(yī)用儀器廠）。

1.1.3 實驗菌株及菌液制備 變形鏈球菌ATCC25923（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室提供）。將復(fù)蘇48 h的菌種接種于TSB液體培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)24 h，然后以3000 r/min離心15 min，收集細菌，無菌生理鹽水洗菌2次，用無菌生理鹽水調(diào)在540 nm波長處吸光度OD為1.0的菌懸液，備用。

1.2 方法

1.2.1 LPE溶液的稀釋及實驗分組 實驗組:采用二倍稀釋法，用含2%蔗糖的TSB液體培養(yǎng)基將LPE稀釋成 1∶800（1.250 μl/ml）→1∶1600（0.625 μl/ml）→1∶3200（0.313 μl/ml）→1∶6400（0.156 μl/ml）→1∶12800（0.078 μl/ml）→1 ∶25600（0.039 μl/ml）的 溶液。對照組：含2%蔗糖的TSB液體培養(yǎng)基（不含LPE）。實驗共分7組，即6個不同濃度的實驗組和1個對照組，每組6個平行管。

1.2.2 菌液培養(yǎng) 將1ml S.mutans菌液（OD值為1）加入到各個濃度10 ml LPE溶液中（1∶10 V/V），在37℃條件下培養(yǎng)6、18、24、48 h。將每個時間點培養(yǎng)物平均分成2份。

1.2.3 S.mutans胞外WIG、WSG的測定 取1份培養(yǎng)液，在3000 r/min條件下，離心30 min，棄上清液。沉淀物用5 ml蒸餾水洗滌，離心2次，合并3次上清液，用于檢測水溶性多糖。水洗后的細菌加0.5 mol/L NaOH 5 ml洗滌，離心3次，合并上清液，用于測量水不溶性多糖。兩部分上清液各取適量，分別加入3倍體積無水乙醇，4℃冰箱放置過夜，離心，棄水相，沉淀分別加入5 ml蒸餾水及5 ml 0.1 mol/L NaOH溶液溶解，用蒽酮法分別測定水溶性及水不溶性葡聚糖含量。

1.2.4 GTF的提取和活性測定 將另一份細菌培養(yǎng)物在3300 r/min條件下離心20 min。上清液加入固體硫酸銨，使達60%飽和度，置于4℃冰箱過夜后，10000 r/min離心30 min，收集沉淀，將沉淀溶于含0.01%NaNO3的 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.4），相同緩沖液中透析48 h，12 h換一次液體，透析至無銨離子檢出為止。透析后的粗提物用聚乙二醇（分子量為10000）濃縮至2 ml，即為粗酶制劑。在粗酶制劑中加入0.5 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.0）0.1 ml，0.5 mol/L 蔗糖 0.1 ml，0.4 ml雙蒸水，37 ℃孵育1 h后，加0.1 ml 0.24 mol/L HCl終止反應(yīng)，再加2.5 ml雙蒸水混均，在2000 r/min下離心5 min，上清液中的還原糖用Neson-Somogyi法測定。GTF活力單位(IU)定義為標(biāo)準(zhǔn)條件下(37℃反應(yīng)1 h)每分鐘從蔗糖釋放1 μmol還原糖所需的酶量，公式為酶活力=W/Mr×1/60 IU/min。W：產(chǎn)生的葡萄糖量，Mr：葡萄糖分子量。

1.2.5 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

1.2.5.1 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定：分別取葡聚糖稀釋液 0.00、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80 ml，加入蒸餾水至1.00 ml，15℃水浴中加入蒽酮試劑3.00 ml，攪拌3 min后放入95℃水浴中煮6 min，冷卻，在分光光度計625 nm處比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定：分別取葡萄糖稀釋液 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0 ml，加入蒸餾水至1.00 ml，再加入溶液A(取純酒石酸12 g，無水碳酸鈉24 g，加水250 ml，攪勻后向此液中緩慢加入10%硫酸銅溶液40 ml和碳酸氫鈉16 g。另取500 ml 40℃熱蒸餾水加入無水硫酸鈉180 g，煮沸驅(qū)逐溶解中的氣體，冷卻后將二液注入1.0 L溶液瓶混合，加蒸餾水定容至1.0 L)1.0 ml置沸水浴煮沸10 min，冷卻后加入溶液B（稱取鉬酸鈉25 g溶于450 ml蒸餾水，再緩慢加入濃硫酸21 ml。另取25 ml蒸餾水溶解砷酸氫二鈉3 g，慢慢加入到上述溶液中，充分混合，37℃放置24 h，溶液逐漸變?yōu)辄S色，移至棕色瓶中保存）1.0 ml，最后加入雙蒸水 9.5 ml，搖勻，在分光光度計620 nm處比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SAS9.0軟件包進行數(shù)據(jù)輸入和分析，各組總體均數(shù)之間比較采用單因素方差分析(ANOVA)；采用Student-Newman-Keuls檢驗進行各樣本組間均數(shù)的兩兩比較；兩變量之間的相關(guān)分析采用Pearson檢驗；標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用REG檢驗；相關(guān)性大小分析采用配對t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果

以葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，蒽酮法測標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行葡聚糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程估計，回歸方程為：y（葡聚糖量）=0.0448+0.2911 x（吸光度值）mg/ml（F=236.50，P<0.01，r=0.973）；以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，Neson-Somogyi測標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程估計，回歸方程為:y（葡萄糖量）=-0.08+1.088x（吸光度值）mg/ml（F=391.00，P<0.01，r=0.968）。

2.2 LPE溶液對S.mutans胞外WIG、WSG的含量影響測定結(jié)果 WIG、WSG含量的測定結(jié)果見表1，在各時間點，隨著LPE溶液濃度的逐漸升高，S.mutans胞外WIG、WSG含量呈下降趨勢，從0.078 μl/ml組到1.250 μl/ml組，各組總體均數(shù)間具有高度顯著性差異(P<0.01)；各濃度組與對照組之間均有高度顯著性差異 (P<0.01)；0.039 μl/ml組與 0.078 μl/ml LPE濃度組WIG之間則無顯著性差異(P>0.05)；在18 h，0.039 μl/ml組與 0.078 μl/ml LPE 濃度組 WSG之間有顯著差異（q=4.80，P<0.01），其余時間點0.039 μl/ml組與 0.078 μl/ml LPE 濃度組 WSG 無顯著性差異(P>0.05）；各濃度組WIG總體均數(shù)在4個時間點間均具有顯著性差異（F=20.42，P<0.01）；除0.039 μl/ml組，各濃度組 WSG 在 18 h 與 6、24、48 h的總體均數(shù)間均具有顯著性差異（F=4.26，P<0.01），6 h與24、48 h的總體均數(shù)間均無顯著性差異（F=0.36，P>0.05）；對照組 WIG、WSG 在 4個時間點的總體均數(shù)間均無差異（P>0.05）。

表1 不同濃度LPE溶液對S.mutans培養(yǎng)不同時間溶液中WIG、WSG的影響（±s,μg/ml）

表1 不同濃度LPE溶液對S.mutans培養(yǎng)不同時間溶液中WIG、WSG的影響（±s,μg/ml）

濃度組與對照組比較*P<0.01，濃度組間比較△P>0.05

319.63 411.89 750.38 1177.89 520.65 384.15 729.23 477.62<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.00148 h 19.918±0.151＊△19.569±0.238＊△18.453±0.339＊14.365±0.294＊12.652±0.339＊10.377±0.300＊28.471±0.2086 h 18.130±0.309＊△18.319±1.150＊△16.670±0.442＊11.670±0.180＊10.387±0.481＊9.237±0.126＊28.420±0.18318 h 14.239±0.314＊△11.900±0.533＊△10.590±0.241＊9.183±0.196＊7.675±0.521＊6.033±0.114＊28.289±0.15824 h 16.107±0.255＊△15.265±0.401＊△14.134±0.201＊11.510±0.333＊9.967±0.276＊7.925±0.205＊28.311±0.25348 h 12.733±0.181＊△12.641±0.201＊△11.481±0.323＊9.982±0.171＊8.997±0.214＊7.871±0.217＊18.996±0.1766 h 12.524±0.199＊△12.476±0.190＊△11.190±0.328＊9.710±0.126＊8.570±0.159＊7.716±0.242＊18.889±0.23518 h 12.660±0.226＊10.894±0.188＊9.069±0.430＊8.109±0.167＊7.284±0.353＊6.688±0.251＊18.855±0.13224 h 12.442±0.188＊△12.252±0.109＊△11.035±0.248＊9.691±0.125＊8.551±0.194＊7.571±0.184＊19.083±0.234 WIG WSG LPE濃度組（μl/ml）0.0390.0780.1560.3130.6251.250對照組FP

2.3 LPE溶液對S.mutans的GTF影響測定結(jié)果

GTF活性測定結(jié)果見表2。在各時間點，隨著LPE溶液濃度的逐漸升高，S.mutans的GTF活性逐漸降低，除 0.039 μl/ml組和 0.078 μl/ml組外，各組酶活力總體均數(shù)間均有顯著性差異(F=55.32，P<0.01)；各LPE濃度組與對照組均數(shù)之間均有顯著性差異 (P<0.01)；0.039 μl/ml與 0.078 μl/ml組之間則無顯著性差異(P>0.05)；各濃度組酶活力的總體均數(shù)在4個時間點間比較均有顯著性差異（F=8.12，P<0.01）；對照組酶活力在48 h與6、18、24 h的總體均數(shù)間均有顯著性差異（F=6.07，P<0.01），而 6 h 與 18、24 h 總體均數(shù)間均無差異（F=0.72，P>0.05）。

2.4 不同濃度LPE溶液對GTF活性與WIG、WSG含量相關(guān)性分析結(jié)果 見表3。在各時間點，各濃度組GTF活性與WIG、WSG含量正相關(guān)，隨著LPE濃度的升高，r值無明顯規(guī)律，但0.313 μl/ml濃度組與其他濃度組的GTF活性與WIG的相關(guān)性有顯著性差異（F=12.35，P<0.01），各濃度組間的 GTF活性與WSG 的相關(guān)性無差異（F=2.34，P>0.05）；GTF活性與WIG含量的相關(guān)性和GTF活性與WSG含量相關(guān)性比較有顯著性差異（t=4.37，P<0.01）。

表2 不同濃度LPE溶液對S.mutans培養(yǎng)不同時間溶液中GTF的影響（±s）

表2 不同濃度LPE溶液對S.mutans培養(yǎng)不同時間溶液中GTF的影響（±s）

濃度組與對照組比較*P<0.01，濃度組間比較△P>0.05

48 h 3.333±0.069*△3.294±0.069*△2.901±0.068*2.124±0.055*1.536±0.054*1.036±0.058*3.925±0.0561419.76<0.0016 h 2.862±0.099*△2.842±0.056*△2.424±0.082*1.833±0.052*1.290±0.047*0.836±0.052*3.816±0.044933.26<0.00118 h 2.320±0.117*△2.266±0.067*△1.711±0.059*1.192±0.097*0.861±0.096*0.292±0.054*3.808±0.062541.56<0.00124 h 2.501±0.010*△2.464±0.053*△2.072±0.064*1.548±0.093*1.074±0.052*0.638±0.057*3.843±0.049649.64<0.001 LPE濃度組（μl/ml）0.0390.0780.1560.3130.6251.250對照組FP酶活力（mIU）

表3 不同濃度LPE溶液對S.mutans培養(yǎng)不同時間溶液中GTF活性與WIG、WSG含量相關(guān)性分析（r）

3 討論

GTF是公認的致齲菌毒力因子。研究已證實，S.mutans和S.Sobrinus至少能產(chǎn)生3種GTF酶，分別命名為GTFI(合成非水溶性葡聚糖)、GTFS(合成水溶性葡聚糖)和GTFSI(合成水溶性和非水溶性葡聚糖)。GTF的合成不需誘導(dǎo)，在菌細胞內(nèi)合成后分泌到菌細胞外，與菌細胞結(jié)合存在于細胞表面，以不溶性葡聚糖介導(dǎo)S.mutans在牙面的粘附，參與菌斑基質(zhì)的形成，促進菌斑成熟；水溶性葡聚糖、果聚糖和細胞內(nèi)多糖則作為代謝底物，提供能量和產(chǎn)酸，延長細菌產(chǎn)酸時間。Kopec等[8]研究也發(fā)現(xiàn)單獨合成非水溶性葡聚糖的GTF(GTF-I)只能合成沒有粘附性能的WIG，但GTF-I與合成水溶性葡聚糖的GTF(GTF-S)一起就可以合成有粘附性能的WIG(ad-WIG)，且這種 WIG 含有一定比例的 α-1，3/α-1，6鍵。他們推測Dex切割WSG，形成更小分子的WSG，小分子WSG可以作為α-1，3葡聚糖的支鏈，并以之為引物合成ad-WIG。形成的ad-WIG則與GTF一起介導(dǎo)變形鏈球菌之間、菌體與葡聚糖、菌體與牙面之間的相互作用，從而使變形鏈球菌粘附、聚集、定植在牙齒的表面并產(chǎn)酸，造成釉質(zhì)脫礦，最終導(dǎo)致齲病的發(fā)生。

本實驗結(jié)果表明，從0.078 μl/ml濃度組起，LPE溶液不僅對WIG的合成有顯著的抑制作用，而且能明顯抑制WSG的合成，隨著濃度的升高，抑制作用顯著增強。這與LPE溶液抗細菌附著結(jié)果相一致[7]，說明LPE溶液可通過抑制S.mutans的蔗糖依賴性粘附，從而達到抑制S.mutans的附著。本實驗還發(fā)現(xiàn)LPE抑制GTF酶的活性，則WIG、WSG的含量也隨之減少，即GTF酶活性與WIG、WSG含量之間呈正相關(guān)，GTF酶活性與WIG含量的相關(guān)性和GTF酶活性與WSG含量的相關(guān)性間比較有顯著差異，即GTF酶活性與WIG含量的相關(guān)性更密切，且以LPE溶液在濃度0.313 μl/ml時，GTF酶活性與WIG含量之間的相關(guān)性最高。

本研究同時發(fā)現(xiàn)，在每個時間點，各濃度組LPE溶液對GTF酶活性的抑制作用和對WIG、WSG含量的抑制作用規(guī)律大致一致。在18 h時，各濃度組LPE對GTF酶活性、WIG含量的抑制作用達到峰值；而對照組對WIG、WSG含量的抑制作用在各個時間點無明顯差異，對GTF酶活性的抑制作用在48 h時有所降低。推測LPE溶液培養(yǎng)18 h對GTF酶活性、WIG含量的抑制作用優(yōu)于其它時間點。

檸檬屬于蕓香科柑橘屬植物，其果皮作為中藥入藥已經(jīng)有悠久的歷史。檸檬含有機酸、礦物質(zhì)、黃酮類化合物、揮發(fā)性芳草香油等物質(zhì)，這些物質(zhì)對微生物具有不同程度生物學(xué)活性，但其具體的活性物質(zhì)與其生物學(xué)效應(yīng)至今尚不清楚。GTF活性取決于酶蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，LPE對GTF活性抑制作用的分子機制尚不清楚，作者推測，LPE與S.mutans接觸后可能取代和破壞了酶蛋白分子三級結(jié)構(gòu)中的鹽鍵、氫鍵和疏水鍵等，破壞了蛋白的空間構(gòu)象，使GTF活性降低。LPE對WIG、WSG的抑制作用則除了直接抑制GTF活性，也可能是競爭性抑制GTF受體的結(jié)果，以上推論需作進一步研究證實。

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