夜香牛的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

陳黃保，胡等芳

(廣東省湛江市藥品檢驗(yàn)所，廣東 湛江 524037)

夜香牛為民間用藥，始載于《嶺南采藥錄》，別名傷寒草、消山虎、寄色草、返魂香、假咸蝦、枝香草[1－2]，為菊科植物夜香牛 Vernonia cinerea(L.)Less的干燥全草，具有清熱、除濕、解毒功效，治外感發(fā)熱、急性黃疸型肝炎、濕熱腹瀉、疔瘡腫毒。為了有效控制其質(zhì)量，筆者采用顯微、薄層色譜(TLC)法進(jìn)行定性鑒別，用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定其中木犀草苷的含量，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀，含DAD檢測(cè)器，Agilent 1100化學(xué)工作站;梅特勒－托利多AG135型電子天平;HENGAO HS3120型超聲清洗儀(功率120 W，頻率40 kHz)。D101大孔吸附樹(shù)脂柱(批號(hào)為050901，天津市海光化工有限公司)。夜香牛于2006年5月在湛江自采，另由廣東恒誠(chéng)制藥有限公司提供兩批，均經(jīng)廣東省湛江市藥品檢驗(yàn)所王其新主任中藥師及筆者鑒定為菊科植物夜香牛 Vernonia cinerea(L.)Less的干燥全草;木犀草苷對(duì)照品(批號(hào)為111520－200201，含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所);乙腈為色譜純;甲醇(色譜純，批號(hào)為051029101，天津市四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 生藥學(xué)鑒定

來(lái)源:本品為菊科植物夜香牛 Vernonia cinerea(L.)Less的干燥全草。原植物為1年生草本，高20～80 cm。莖直立，上部有分枝，稍被灰白色短茸毛，有縱向條紋，葉互生，具柄;葉片披針形至卵形或倒孵形，長(zhǎng) 3.5 ～6.5 cm，寬 1.5 ～3.5 cm，先端鈍或尖，基部楔形，邊緣有淺齒或波狀齒，背脈明顯，側(cè)脈3～4對(duì)，兩面均被疏毛。花全年開(kāi)放，頭狀花序長(zhǎng)約 0.7 cm，寬 0.3 cm，具柄排成疏散的傘房狀圓錐花序，總苞較花短，總苞片尖銳，小花約20朵，兩性，全為管狀花，淡紫紅色。瘦果圓柱形，灰褐色，長(zhǎng)約0.2 cm，項(xiàng)端被白色冠毛[3](見(jiàn)圖1)。

圖1 夜香牛原植物圖

性狀:本品莖呈圓柱形，上部有分枝，長(zhǎng)20～80 cm，直徑 0.2～0.4 cm;表面綠褐色，有縱皺紋，稍被白色短茸毛。葉互生，多皺縮或脫落，展開(kāi)后呈披針形、孵形或倒孵形，邊緣有淺齒或呈微波狀。頭狀花序頂生，總苞綠褐色或黃棕色。瘦果圓柱形，灰褐色，長(zhǎng)約0.2 cm，頂端被白色冠毛。根淡黃色，細(xì)小，多分支。質(zhì)脆，易折斷，斷面髓部白色。氣微，味淡(見(jiàn)圖2)。

顯微特征:本品莖橫切面觀呈圓形，邊緣有突出的棱角。表皮細(xì)胞1列，呈類(lèi)方形，外被角質(zhì)層，并可見(jiàn)非腺毛，棱角處有厚角組織。皮層細(xì)胞類(lèi)圓形，有的作徑向排列，內(nèi)含黃綠色色素。中柱鞘纖維束呈帽狀，約16～25束斷續(xù)排列成環(huán)。韌皮部窄。形成層成環(huán)，次生木質(zhì)部導(dǎo)管呈圓形或橢圓形，直徑8～56μm，單個(gè)散在;射線細(xì)胞2～9列;近髓部處有初生木質(zhì)部。髓部寬廣，薄壁細(xì)胞較大，呈圓多角形(見(jiàn)圖3)。

圖2 夜香牛藥材圖

2.2 薄層色譜鑒別

取本品粉末2 g，加水50 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液加鹽酸至酸性，濾過(guò)，用乙酸乙酯振搖提取3次(每次15 mL)，合并乙酸乙酯溶液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取夜香牛對(duì)照藥材2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照TLC法[2005年版《中國(guó)藥典(一部)》附錄Ⅵ B]試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯－乙酸乙酯－甲酸－水(6∶3∶1∶3)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵試液與1%鐵氰化鉀試液(1∶1)混合溶液。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)(見(jiàn)圖4)。

2.3 木犀草苷含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動(dòng)相:甲醇－0.2%磷酸溶液(44∶56);檢測(cè)波長(zhǎng):350 nm;柱溫:室溫;流速:1.0 mol/L;進(jìn)樣量:20 μL。理論板數(shù)按木犀草苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3500。色譜圖見(jiàn)圖5。

2.3.2 溶液制備

精密稱取藥材粉末2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率120 W，頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò);精密量取續(xù)濾液30 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状技s5 mL使溶解，加到預(yù)先處理好的D101大孔吸附樹(shù)脂柱(內(nèi)徑1.5 cm，柱高15 cm)上，用水50 mL洗滌，再用甲醇100 mL洗脫，棄去前15 mL，收集續(xù)洗液，蒸至近干，殘?jiān)蛹状?0 mL使溶解，轉(zhuǎn)移至150 mL圓底燒瓶中，加入鹽酸9 mL，置水浴中加熱回流30 min，放冷，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取木犀草苷對(duì)照品適量，精密稱定，加2 mol/L鹽酸甲醇溶液制成每1 mL含2.5 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

圖3 夜香牛莖橫切面顯微特征(×400)

圖4 夜香牛薄層色譜圖

圖5 夜香牛高效液相色譜圖

2.3.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密量取對(duì)照品溶液(9.27 μg/mL)1，2，4，8，10 mL，置10 mL量瓶中，加2 mol/L鹽酸甲醇溶液至刻度，搖勻，即得每 1 mL 含 0.927，1.854，3.708，7.416，9.270 μg 的系列溶液。分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，依法測(cè)定，以對(duì)照品的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=76.32 X+0.0575，r=0.9998(n=5)。結(jié)果表明，木犀草苷質(zhì)量濃度在0.927～9.270 μg/mL之間與峰面積線性關(guān)系良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批供試品(批號(hào)為060301)溶液6份，依法測(cè)定。結(jié)果的 RSD為1.5%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一份供試品(批號(hào)為060301)溶液，分別在制備后 0，2，4，6，8，12 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的 RSD 為 0.83%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

中間精密度試驗(yàn):取同一批樣品(批號(hào)為060301)6份，由A，B，C 3人分別在不同的時(shí)間用同一臺(tái)設(shè)備，依法測(cè)定。結(jié)果的 RSD為0.46%，表明中間精密度良好。

回收率試驗(yàn):取同一批(批號(hào)為060301，含量0.139 mg/g)已知含量的樣品1 g各6份，分別精密加入對(duì)照品溶液(154.5 μg/mL)0.5，1.0，1.5 mL，平行操作 2 份，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表 1。

2.3.4 樣品含量測(cè)定

取不同樣品，依法測(cè)定其中木犀草苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

TLC定性鑒別中，關(guān)于供試品溶液的制備，曾采用回流法，比較了水、70%乙醇、酸性乙醇3種溶劑，結(jié)果以水回流、加鹽酸至酸性、用乙酸乙酯提取的效果較好;還比較了乙酸乙酯－丁酮－甲酸(10∶7∶1)、甲苯(水飽和)－乙酸乙酯 －甲酸(5∶4.5∶0.5)、甲苯 －乙酸乙酯－甲酸－水(6∶3∶1∶3)的上層溶液等3種展開(kāi)劑，結(jié)果以最后一種的上層溶液展開(kāi)效果較好;也比較了紫外光燈(365 nm)下觀察，以1%三氯化鐵試液與1%鐵氰化鉀試液(1∶1)混合溶液為顯色劑兩種方法，結(jié)果后一種的顯色效果較好。

表1 木犀草苷回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

據(jù)文獻(xiàn)記載，夜香牛全草顯黃酮、酚類(lèi)、氨基酸等化學(xué)反應(yīng)[2]，從全草中可分離得香葉木素、木犀草素、木犀草素－7－O－葡萄糖苷等有抑菌和促進(jìn)消化系統(tǒng)蠕動(dòng)作用的成分。故根據(jù)其所含成分并參照2005年版《中國(guó)藥典(一部)》中獨(dú)一味膠囊的測(cè)定方法[4]，選擇木犀草苷作為含量測(cè)定指標(biāo)。在木犀草苷含量測(cè)定時(shí)，取木犀草素對(duì)照品的甲醇溶液(0.1 mg/mL)，在紫外分光光度計(jì)250～400 nm波長(zhǎng)間掃描，結(jié)果在350.2 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，與文獻(xiàn)[4]的測(cè)定波長(zhǎng)(350 nm)基本一致，故以350 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

關(guān)于含量測(cè)定時(shí)供試品溶液的制備條件選擇，曾考察藥材的乙酸乙酯、乙醇提取液，液相色譜均末見(jiàn)游離木犀草苷峰，而經(jīng)酸水解后高效液相色譜可見(jiàn)游離木犀草苷峰，說(shuō)明夜香牛的木犀草苷以不同的苷類(lèi)形式存在，故需水解才能測(cè)定;比較了超聲法及回流法，結(jié)果用超聲法提取效果最佳;曾分別用不同量的水、甲醇、75%乙醇、乙醇洗脫，結(jié)果用100 mL以內(nèi)的水洗滌，可除去大部分水溶性雜質(zhì)且對(duì)被測(cè)成分無(wú)影響，用甲醇、75%乙醇、乙醇洗脫結(jié)果無(wú)明顯差異，但以甲醇洗脫、棄去前15 mL再收集續(xù)洗液的效果稍優(yōu);曾分別將樣品置水浴中回流15，30，45 min，結(jié)果水解30 min的效果較好;曾分別加入鹽酸 4.5，9.0，11.0 mL 考察酸濃度，結(jié)果溶液中酸的濃度為2.5 mol/L時(shí)水解較適合。另外，曾對(duì)甲醇提取液不過(guò)柱直接水解，由于部分糖對(duì)測(cè)定有影響，結(jié)果回收率較低，故不宜采用。

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(上冊(cè))[M].上海:上海人民出版社，1977:916.

[2]《全國(guó)中草藥匯編》編寫(xiě)組.全國(guó)中草藥匯編(上冊(cè))[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1978:472.

[3]中國(guó)科學(xué)院植物研究所.中國(guó)高等植物圖鑒(第四冊(cè))[M].北京:科學(xué)出版社，1987:402.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:541.