表沒食子兒茶素沒食子酸酯對局灶性腦缺血－再灌注損傷的影響

段秀君

(河南省鶴壁市食品藥品檢驗所，河南 鶴壁 458030)

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)屬于茶多酚中黃烷醇類，其基本結構為2-鄰苯酚基苯并吡喃衍生物，具有很強的清除自由基、抗氧化功效[1-3]。關于EGCG是否能改善腦缺血-再灌注損傷時腦組織代謝障礙，尚未見報道。筆者采用線栓法建立大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血-再灌注損傷模型，并進行神經功能行為學評分、腦組織乳酸含量及能量代謝酶活性測定，旨在探討EGCG對腦缺血-再灌注損傷的預防作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 試藥、動物及儀器

藥品與材料:EGCG(美國sigma公司，批號為E4143);乳酸檢測試劑盒、三磷酸腺苷(ATP)酶檢測試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)。雄性SD大鼠，體重270～330 g，河南省實驗動物中心提供，動物合格證號為410175。722型紫外分光光度計(上海第三分析儀器廠)。

1.2 實驗設計

采用線栓致可逆性大鼠大腦中動脈阻斷(middle cerebral artery occlusion，MCAO)方法造成局灶性腦缺血-再灌注損傷模型。選用雄性SD大鼠80只，隨機分成5組，每組16只，即假手術組、缺血-再灌注模型組(I/R)、EGCG高劑量組(100 mg/kg)、EGCG中劑量組(50 mg/kg)、EGCG低劑量組(25 mg/kg)。術前60 min采用腹腔給藥的方式，注射不同質量分數的EGCG溶液，假手術組和模型組則分別給予等量的生理鹽水。

1.3 模型建立

用10%水合氯醛麻醉(300 mg/kg)大鼠，分離暴露出左側頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)、頸內動脈(internal carotid artery，ICA)和翼腭動脈(Pterygopalatine artery，PPA)和迷走神經。依次游離并電凝右ECA的所有分支，結扎ECA的主干。分離ICA至顱底，在PPA的起始處結扎PPA，僅保留ICA入顱主干。將預先準備好的尼龍線(尼龍線頭端燒成光滑的線拴，直徑約為0.25 mm)經ECA主干的切口插入到大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)的起始處，大約離頸內、頸外靜脈分叉處約18 mm，感到阻力時，即完成一側MCA阻塞。縫合切口，將尼龍線的尾端留在皮外，再灌注時將尼龍線輕輕外抽，感到阻力時，意味著尼龍線的頭端已回到ECA的主干中，從而實現MCA的再灌注。假手術組只進行麻醉和血管分離術，不結扎血管及導入線栓。

1.4 觀察指標及方法

神經功能缺損評分:腦缺血1 h、再灌注24 h后，采用Longa等[4]的神經功能學評分法檢測動物神經損傷程度。肢體活動正常記為0分;梗死對側前爪內收、不能伸直記為1分;向偏癱側轉圈者記為2分;自主運動時向偏癱側傾倒記為3分;無自主活動，并伴意識障礙記為4分。

腦組織含水量測定:進行神經功能評分后，將大鼠斷頭處死，取出右側腦組織，用濾紙吸干表面水份，立即于電子天平稱重(濕質量)，120℃恒溫烘烤24 h至恒重后再次稱重(干質量)，采用干濕質量法測定腦組織含水量，按Ellis公式[5]計算腦組織含水量。腦含水量=(濕質量-干質量)/濕質量×100%。

腦組織勻漿制備:將大鼠按時斷頭，取右側腦組織，稱取腦組織塊約0.5 g，用預冷的生理鹽水沖洗組織表面的血液，濾紙吸干，再次稱重，置電動玻璃勻漿器中，加入預冷的生理鹽水制成腦組織勻漿，再以4℃低溫、3 000 r/min轉速離心10 min，取上清液，貯存于-20℃冰箱保存，備用。

生化指標測定:按照試劑盒說明，以比色法測定乳酸的含量和Na+-K+-ATP酶的活性，以考馬斯亮藍法測定蛋白的含量。

1.5 數據處理

2 結果

結果見表1。可見大鼠腦缺血1 h再灌注24 h后，模型組神經功能缺損評分、腦組織含水量及腦組織乳酸含量明顯升高，腦組織Na+-K+-ATP酶活性明顯降低，與假手術組比較，差異具有顯著性(P＜0.05);EGCG各劑量組神經功能缺損評分、腦組織含水量及腦組織乳酸含量明顯降低，腦組織Na+-K+-ATP酶活性明顯升高，與模型組比較，差異具有顯著性(P＜0.05)。

表1 EGCG對大鼠腦缺血再灌注損傷神經功能評分及腦組織含水量的影響(X ±s，n=8)

3 討論

EGCG的脂溶性高，能有效通過血腦屏障[6]，清除自由基，降低脂質過氧化[7-8]，從而具有神經保護作用。

由于腦的能量代謝具有對氧的需求量大、靠血液轉運葡萄糖供能、沒有糖原及ATP的儲備等特性，所以當腦缺血時腦組織必須采用無氧酵解的方式代謝葡萄糖獲得能量，而無氧酵解途徑的能量產生有限，會出現能量耗竭，神經元處于能量低下狀態，引起進一步繼發病理狀態，從而引起神經元的損傷和死亡[9]。在氧供不足的情況下，糖代謝產生的丙酮酸在乳酸脫氫酶的催化下生成乳酸，因此乳酸的水平反映了組織無氧酵解的程度。而腦組織中乳酸的蓄積也會進一步引起神經元的損傷，造成惡性循環。由于ATP酶直接以ATP為底物，其活性直接受到組織ATP水平的影響。腦缺血后ATP生成減少以及缺氧可導致缺血酸中毒，腦組織內酸性代謝產物增多，使得ATP酶活性降低，因此ATP酶活性可以反映細胞的能量水平。腦缺血-再灌注損傷后，能量耗竭，ATP產生不足，Na+-K+-ATP酶活性下降，導致細胞內Na+濃度增高引起細胞毒性腦水腫而影響細胞功能[10]，從而造成神經損傷。缺血-再灌注組大鼠的腦組織乳酸水平顯著升高，ATP酶活性顯著下降，這兩方面的結果共同反映了缺血-再灌注損傷大鼠腦組織神經元氧供不足，能量代謝障礙。

本研究結果表明，EGCG能明顯降低大鼠大腦中動脈缺血-再灌注損傷腦組織含水量和乳酸的生成，提高缺血腦組織的ATP酶活性，改善能量代謝障礙的狀況，增加腦組織能量供應，減輕因能量耗竭引起的神經系統損害，從而對腦神經起到保護作用。

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