微生物限度檢查薄膜過濾法供試液預(yù)處理方法探討

苑思坤，李玉芝，王紅云

(河北省保定市藥品檢驗(yàn)所，河北 保定 071000)

某些中藥制劑具有較強(qiáng)的抑菌作用，需要采用薄膜過濾法對其進(jìn)行微生物限度檢查。在過濾過程中，供試品溶液中的不溶雜質(zhì)常使0.45μm微孔濾膜阻塞，從而導(dǎo)致過濾速度極慢甚至不能過濾，極大地影響了檢驗(yàn)的進(jìn)行。如果前期能用某種濾材過濾掉供試液含有的大量極細(xì)粉及不溶性物質(zhì)，則能極大地提高0.45μm濾膜的過濾速度，從而提高檢驗(yàn)的效率和準(zhǔn)確性。筆者考察了檢驗(yàn)中常見的幾種濾材，以確定其是否可用于供試液的過濾前處理。

1 環(huán)境與儀器、材料

環(huán)境為環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)。開放式薄膜過濾器(濾孔直徑0.45μm);醫(yī)用脫脂棉(定州市寶塔衛(wèi)生材料有限公司、山東陽谷景陽崗衛(wèi)生材料廠、邢臺太行醫(yī)用材料有限公司);醫(yī)用脫脂紗布(定州市寶塔衛(wèi)生材料有限公司);中速定性濾紙(杭州富陽特種紙業(yè)有限公司)。

實(shí)驗(yàn)菌株[1]為大腸埃希菌 Escherichia coli.[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus.[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis.[CMCC(B)63501]、白色念珠菌 Candida albicans.[CMCC(F)98001]、黑曲霉 Aspergillus niger[CMCC(F)98003]。

培養(yǎng)基包括營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號為080925)，玫瑰紅鈉培養(yǎng)基(批號為080925)，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號為070111)，改良馬丁培養(yǎng)基(批號為070105)。實(shí)驗(yàn)菌株及培養(yǎng)基均購自中國藥品生物制品檢定所。稀釋液及沖洗液為pH=7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備[2]

分別取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌，置營養(yǎng)肉湯新鮮培養(yǎng)液中培養(yǎng)18～24 h，白色念珠菌置改良馬丁液體培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)液中培養(yǎng)18～24 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫黑曲霉孢子，按2005年版《中國藥典(一部)》微生物限度檢查法項(xiàng)下規(guī)定制備成50～100 CFU/mL的菌液。

2.2 濾材制備

取醫(yī)用脫脂棉5 g，制成直徑11 cm的均勻圓餅;取紗布折疊成32層，用剪刀剪成直徑11 cm的圓餅;另取濾紙一片(直徑11 cm)。將上述3種濾材在121℃下濕熱滅菌。

2.3 菌液組回收率測定

以規(guī)定濃度的菌懸液作為對照菌液A，取1 mL，培養(yǎng)，計(jì)數(shù);另將對照菌液A分別用不同濾材過濾，續(xù)濾液作為對照菌液B，取1 mL，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。平行做3次試驗(yàn)。回收率按下式計(jì)算:回收率=對照菌液B平均菌落數(shù)/對照菌液A平均菌落數(shù)×100%。結(jié)果見表1。可知，用醫(yī)用脫脂棉、醫(yī)用脫脂紗布過濾，回收率均接近100%，證明其對細(xì)菌、霉菌無攔截作用;采用濾紙過濾，幾種菌回收率為20%～50%，可見其對細(xì)菌、霉菌有明顯的攔截作用，不宜作為預(yù)處理用濾材。

表1 菌液組回收率測定結(jié)果(%)

2.4 樣品組回收率測定

取規(guī)定濃度的菌懸液，加等量供試液作為試驗(yàn)菌液C，取1 mL，置開放式過濾器中，用1000 mL沖洗液沖洗(前期驗(yàn)證試驗(yàn)證明，該藥的微生物限度檢查可采用薄膜過濾法，沖洗量為1000 mL)，然后取出濾膜貼于制備好的平皿中，培養(yǎng)，計(jì)數(shù);另將試驗(yàn)菌液C分別用棉花和紗布過濾，續(xù)濾液作為試驗(yàn)菌液D，取1 mL，同法培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。平行做3次試驗(yàn)。回收率按下式計(jì)算:回收率=試驗(yàn)菌液D平均菌落數(shù)/試驗(yàn)菌液C平均菌落數(shù)×100%。結(jié)果見表2。可見，試驗(yàn)中樣品組采用醫(yī)用脫脂棉、醫(yī)用脫脂紗布過濾，回收率均仍接近100%，證明其對細(xì)菌、霉菌無攔截作用;但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，醫(yī)用脫脂紗布對極細(xì)粉和不溶性懸浮粒子的攔截作用較差，導(dǎo)致薄膜過濾困難，過濾時間甚至長達(dá)1 h，影響試驗(yàn)效率;而醫(yī)用脫脂棉則能有效濾除樣品溶液中的極細(xì)粉和懸浮物。因此，對于那些含不溶性雜質(zhì)較多的供試品溶液，醫(yī)用脫脂棉是一種很好的前處理濾材。

表2 樣品組回收率測定結(jié)果(%)

2.5 醫(yī)用脫脂棉考察

考察了3個廠家的脫脂棉產(chǎn)品。結(jié)果見表3。可見，不同廠家的醫(yī)用脫脂棉，其菌液回收率無明顯差異，對細(xì)菌均無攔截作用，均適用于微生物限度檢查。另外，還考察了脫脂棉的用量(3，5，7 g)，結(jié)果用量為3 g時濾液較難通過薄膜過濾;用量為5 g和7 g時尚可，按2.3項(xiàng)下方法測定，回收率均無太大差異，但7 g圓餅吸附濾液較多，因此用量5 g最為合適。

表3 不同廠家醫(yī)用脫脂棉過濾樣品組回收率測定結(jié)果(%)

3 討論

結(jié)果表明，用滅菌后的醫(yī)用脫脂棉預(yù)先濾除不溶性雜質(zhì)，能在不影響試驗(yàn)結(jié)果的情況下，有效增加薄膜過濾法的過濾速度，提高試驗(yàn)效率，減少誤差。醫(yī)用脫脂棉具有價格低廉、濾孔細(xì)密、操作簡便快速等優(yōu)點(diǎn)，因此在采用薄膜過濾法的微生物限度檢查中，醫(yī)用脫脂棉作為含有較多懸浮物或其他不溶物質(zhì)的供試液的預(yù)處理材料是可行的。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:212.

[2]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2005:325.