氧化應激對尿毒癥大鼠腦缺血再灌注損傷的影響

陳 志,孫珉丹,宋 東,宋志宇

(吉林大學第一醫院,吉林 長春 130021)

氧化應激對尿毒癥大鼠腦缺血再灌注損傷的影響

陳 志,孫珉丹,宋 東,宋志宇*

(吉林大學第一醫院,吉林 長春 130021)

*通訊作者

近年來慢性腎臟病(CKD)和腦血管病的發病率呈逐年增高趨勢,已成為人類面臨的嚴重公共衛生問題[1]。尿毒癥是各種原發或繼發的慢性腎臟疾病不斷惡化、進展的最終階段,其中心腦血管系統受累最重,是影響尿毒癥患者預后的主要因素;在中樞神經系統,尿毒癥病人腦血管病的發病率較高,其死亡率即使在透析病人中也占據很大比率。然而,有關尿毒癥病人發生腦缺血再灌注損傷后的病理生理變化及其機制尚未見報道。本文以尿毒癥大鼠為研究對象,動態觀察其發生腦缺血再灌注后腦組織中自由基含量、抗氧化能力的變化以及病理改變,從而明確尿毒癥體內長期存在的氧化應激對中樞神經系統的影響,為臨床治療尿毒癥合并缺血性腦血管病提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性Wistar大鼠30只,體重250-280 g,實驗室條件適應性喂養1周,術前自由進食飲水,隨機分為單純尿毒癥組(CRF組)6只、尿毒癥合并腦缺血再灌注組(CRF+I/R組)24只,制備尿毒癥模型,成模后,再取同樣大鼠30只,隨機分為正常對照組(N組)6只、單純腦缺血再灌注組(I/R組)24只。所有4組大鼠中,除N組和CRF組外,其余兩組大鼠再制作大腦中動脈栓塞模型。腦缺血2小時后再灌注,按再灌注后不同時間點(0 h 、2 h、12 h、24 h)I/R 組 、CRF+I/R 組又分為4個亞組,每個亞組6只。參照文獻方法[2,3],制備5/6腎切除尿毒癥大鼠模型及大鼠大腦中動脈栓塞再灌注(MCAO)模型。實驗過程中,手術不成功、造模失敗及24 h內死亡的大鼠均棄之不用。用同一批次的大鼠制成合格模型后補足數目。

1.2 取材 每個亞組及N組、CRF組各取6只大鼠,在冰水浴中用玻璃勻漿器制成10%的腦勻漿,用離心機3 000 r/min,離心15 min,取上清液用于檢測丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)。

1.3 比色法檢測腦組織勻漿中MDA、SOD 嚴格按試劑盒說明書操作(購自南京建成生物工程研究所),并按公式計算MDA含量和SOD活力。

1.4 統計學方法 采用SPSS16.0版統計軟件進行資料分析,所有數據以±s表示,多樣本均數比較用方差分析,兩兩比較采用SNK法,兩樣本均數比較用t檢驗,P＜0.05作為顯著性差異的界值。

2 結果

2.1 MDA、SOD的變化 與N組相比,CRF組大鼠腦組織中SOD活力降低,MDA含量升高,但無統計學差異(P＞0.05);與I/R組各時間點相比,CRF組大鼠SOD活力均升高,MDA含量下降,且均有顯著差異(P＜0.05)。發生再灌注損傷的兩組大鼠腦組織在再灌注后0-24 h之間SOD活力均呈逐漸下降趨勢,MDA含量則呈上升趨勢,CRF+I/R組各時間點SOD活力均較其余三組明顯下降,MDA含量明顯升高(P＜0.05)。(見表1、2)

3 討論

表1 各組大鼠不同時間點 MDA的變化(μ mol/g,±s,n=6)

表1 各組大鼠不同時間點 MDA的變化(μ mol/g,±s,n=6)

▲尿毒癥組與對照組相比,無顯著差異(P＞0.05);▼缺血再灌注組各時間點與尿毒癥組相比,有顯著差異(P＜0.05);△尿毒癥+缺血再灌注組各時間點與各組相比,均有顯著性差異(P＜0.05)。下同。

組別 0 h 2 h 12 h 24 h對照組 2.12±0.49尿毒癥組▲ 2.38±0.67缺血再灌注組▼ 3.35±0.40 3.43±0.67 3.83±0.48 4.75±0.46尿毒癥+缺血再灌注組△ 5.48±0.45 5.28±0.47 6.70±0.58 7.95±0.65

大量動物實驗和臨床資料都證實,氧自由基(ROS)參與了腦缺血再灌注的損傷過程[4,5]。生理條件下,ROS的生成和清除能保持平衡,機體產生的少量自由基可被機體較強的防御系統所抑制,不致引起病理效應。這些防御系統包括:自由基生成抑制劑,如過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)等及清除自由基的抗氧化物,如維生素C、維生素E等。病理情況下,自由基產生增多,而自由基清除酶活性下降,抗氧化物減少,使增多的自由基通過一系列的過氧化反應造成組織細胞的損傷,這些損傷包括脂質、蛋白質、核酸的過氧化,其中主要損害是產生脂質過氧化物,再經過氧化物酶分解成丙二醛(MDA),MDA可使磷脂、蛋白質、核酸發生交聯、變性,產生脂褐素堆積在細胞,促使細胞結構和功能的破壞[6]。由于MDA是細胞內脂質過氧化反應的最終產物,化學性質穩定,且其含量能夠體現組織細胞中的含量,因此常用來反映脂質過氧化損傷的程度。在自由基防御體系,SOD是主要存在于細胞漿和線粒體內的一種金屬蛋白酶,對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用,被認為是防御自由基的第一道防線[7],能催化O2-?轉變為H2O2的歧化反應,清除引發自由基連鎖反應的起始基O2-?。GSH-PX幾乎在所有組織中分布,是機體內廣泛存在的一種重要的催化H2O2分解的酶,它特異地催化還原型谷胱甘肽對H2O2的還原反應[8]。H2O2是半衰期最長的,被認為是ROS主要的氧化信號介導者。有實驗證實[9],外源性GSH能完整通過血腦屏障進入腦組織,一般認為它在細胞內能清除有害的過氧化物代謝產物,阻斷脂質過氧化鏈鎖反應,從而起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。在腦內含有高濃度的GSH-PX,幾乎不含過氧化氫酶,因此,主要通過GSH-PX來清除腦內的H2O2。發生腦缺血再灌注后,氧一方面在黃嘌呤氧化酶作用下產生新的氧自由基,同時又使原來因氧耗竭而停滯的氧自由基向脂質過氧化物轉化的過程得以繼續,從而加重了細胞損傷[10]。本研究中,除正常對照組外,其余三組大鼠腦組織中MDA含量均不同程度升高,并且與再灌注的時間呈正相關,相應的SOD、GSH-PX活性在三組中都下降。其中,單純尿毒癥組大鼠發生的氧化反應最輕,單純腦缺血再灌注組次之,而尿毒癥合并腦缺血再灌注組的氧化應激反應最重。尿毒癥患者體內長期處于高氧化水平已經是一個不爭的事實,由于尿毒癥病人腎小球濾過功能、腎小管重吸收功能均不同程度喪失,導致體內氧化產物過多積聚,氧化產物和還原物質之間固有的平衡被打破,氧化過程相對占優勢,其后果之一就是動脈粥樣硬化加重,從而發生嚴重的心腦血管事件,這也是尿毒癥病人易發生腦血管疾病的原因之一,也是尿毒癥病人合并腦血管病高死亡率的原因之一。但對于尿毒癥合并腦缺血再灌注損傷后的病理生理改變目前尚未查到文獻報道。在我們的研究中,單純尿毒癥組大鼠的腦組織中過氧化物的含量高于正常,其抗氧化物質減少,活性降低,表明尿毒癥大鼠體內長期存在的氧化應激對神經系統的影響,只是氧化應激的強度較腦缺血再灌注組弱;而尿毒癥并腦缺血再灌注損傷組大鼠腦組織受到的過氧化損害明顯重于單純腦缺血再灌注組和單純尿毒癥組,自身的抗氧化能力下降明顯,提示尿毒癥的氧化應激加重了腦缺血再灌注損傷,表明對尿毒癥患者長期給予抗氧化治療的必要性和重要性。

表2 各組大鼠不同時間點 SOD的變化(U/mg)(±s,n=6)

表2 各組大鼠不同時間點 SOD的變化(U/mg)(±s,n=6)

組別 0 h 2 h 12 h 24 h對照組 239.83±16.79尿毒癥組▲ 239.50±13.05缺血再灌注組▼ 119.83±10.65 114.67±10.17 102.67±8.09 95.17±6.71尿毒癥+缺血再灌注組△ 93.00±5.93 92.17±5.31 80.83±6.49 67.67±5.16

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1007-4287(2010)09-1384-02

2009-11-18)