血紅蛋白H病的高效液相色譜與血液學特點分析

張 力,區小冰,顏慕霞

(廣州市婦女兒童醫療中心兒童院區血液室,廣東廣州 510120)

血紅蛋白H病的高效液相色譜與血液學特點分析

張 力*,區小冰,顏慕霞

(廣州市婦女兒童醫療中心兒童院區血液室,廣東廣州 510120)

目的分析血紅蛋白H病(HbH病)在高效液相色譜及臨床血液學表現的特點并探討其原因。方法運用高效液相色譜技術(HPLC)對廣東地區49例缺失型或血紅蛋白Constant Spring(HbCS)復合HbH病進行診斷,詳細記錄其臨床資料并測定其相關的血液學指標。結果①缺失型HbH病患兒可見一HbH峰,HbCS復合HbH病患兒既可見-HbH峰,又可見-HbCS峰。49例HbH病患兒中,缺失型HbH病38例(77.7%),HbCS復合HbH病11例(22.3%);②與缺失型HbH病患兒相比,HbCS復合HbH病患兒有明顯的脾腫大,發育障礙及嚴重的貧血,其平均紅細胞體積(MCV)增大,HbH包涵體含量增高。結論①HbH病以缺失型為主,HbCS復合HbH病在HPLC中可出現特異的HbCS峰。②高HbH包涵體含量以及α CS鏈在紅細胞膜上的聚集是造成HbCS復合HbH病患兒臨床表現比缺失型HbH病患兒嚴重的原因。

血紅蛋白H病;高效液相色譜技術;臨床表現

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1417)

血紅蛋白H病(HbH病)屬于α地中海貧血(α地貧),其產生的分子基礎是由于4個α基因中有3個缺失或缺陷。α鏈合成嚴重不足,相對過剩的β鏈自行聚合為4聚體即血紅蛋白H(HbH),HbH的性質不穩定,易形成包涵體,沉積于紅細胞內,使紅細胞的變形性和通透性發生改變,紅細胞在通過脾臟時易于被破壞,出現貧血等臨床癥狀。

HbH病可分為缺失型與非缺失型兩大類,缺失型HbH病在外周血中可檢出HbH。非缺失型HbH病在我國主要為血紅蛋白Constant Spring(HbCS)和血紅蛋白Quong Sze(HbQS)復合HbH病[1]。其外周血中除了有HbH外,還有HbCS或HbQS。HbCS屬于不穩定血紅蛋白,易于降解,在一般的血紅蛋白電泳實驗中不易檢出。用分子生物學的方法可以準確診斷HbCS復合HbH病,但是分子生物學的方法操作較為復雜,對技術人員要求高,整個操作過程不易質控與標準化,不適于在廣大臨床實驗室廣泛開展。我們用高效液相色譜的方法檢測HbH病患兒,并對他們的臨床表現及血液學參數進行了研究。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2007年10月-2008年10月我院住院或門診貧血的患兒49例,男31例,女18例,年齡2-13歲,均為廣東籍,漢族,其間無親緣關系,按張之南《血液病診斷和療效標準》第二版[2],經分子生物學診斷為HbH病。

1.2 方法

1.2.1 常規血液學檢查 用全自動血細胞分析系統(Cell Dyn 1700,美國COULTER公司。)檢測紅細胞計數(RBC),血紅蛋白(Hb),紅細胞平均體積(MCV),紅細胞平均血紅蛋白(MCH),紅細胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)等紅細胞參數的測定。HbH包涵體測定按《全國臨床檢驗操作規程》[3]進行。

1.2.2 Hb高效液相色譜(HPLC)分析 取EDTA抗凝血2 ml(BD抗凝管)無須制備溶血液直接上高效液相色譜儀(VARIANT Ⅱ,美國 Bio-Rad公司。)分析。按儀器說明書操作,血紅蛋白各成份定量約7分鐘后由HPLC分析儀自動分析計算。

1.2.3 3種缺失型α地貧基因(--SEA,-α4.2,-α3.7)分析 采用跨越斷裂點聚合酶鏈反應(Gap-PCR)方法進行,具體步驟見文獻[4]。

1.2.4 2種非缺失型α地貧基因(HbCS,HbQS)分析采用反向點雜交方法進行,具體步驟見文獻[5]。

2 結果

圖1 HbH病患兒HPLC圖譜

2.2 HbCS復合HbH病患兒的臨床表現較缺失型HbH病患兒嚴重,其患兒脾臟腫大,依賴輸血的比例均高于缺失型HbH病患兒,結果見表1。

2.3 缺失型與非缺失型HbH病患兒均表現出小細胞低色素性貧血,但程度有所差異。HbCS復合HbH病患兒的貧血程度,MCV,以及HbH包涵體的水平均高于缺失型HbH病患兒。結果見表2。

表1 缺失型與非缺失型HbH病患兒臨床表現的比較

表2 兩組患兒血液學參數的比較(±s)

表2 兩組患兒血液學參數的比較(±s)

注:與缺失型HbH病比較:1)P＜0.05,2)P＜0.01

血液學檢查 缺失型HbH病 HbCS復合HbH病RBC(×1012/L) 4.77±0.71 3.47±1.071)Hb(g/L) 98.0±11.0 71.0±9.02)MCV(fl) 67.1±7.1 77.7±5.72)MCH(pg) 19.9±1.4 20.2±1.8 MCHC(g/L) 296.6±19.3 260.0±13.72)HbH包涵體(%) 20.2±4.7 70.3±7.11)

3 討論

HbH病的分子遺傳學機制有異質性,其分子缺陷的背景十分復雜,具有種族和地域差異[6]。本文對49例HbH病患兒的檢測表明,HbH病以缺失型為主(77.7%),非缺失型HbH病主要為HbCS復合HbH病,占HbH病的一小部分(22.3%)。

本研究的臨床資料HbCS復合HbH病患兒的臨床表現要比缺失型HbH患兒嚴重。血液學指標亦支持這一觀點:此類患兒的Hb含量低于缺失型HbH病患兒,紅細胞MCV增大,紅細胞內HbH包涵體含量遠高于缺失型HbH病患兒。近來有研究HbH包涵體是引起組織缺氧的原因,其含量與紅細胞計數呈負相關[7]。與此同時,HbCS復合HbH病患兒同缺失型HbH病患兒相比,除了有高水平的HbH包涵體含量外,還有多余的α CS鏈。α CS鏈在紅細胞膜上的聚集可損害紅細胞膜上的Na-K聯合轉運通道,其氧化產物還會與紅細胞膜上的骨架蛋白發生作用,造成紅細胞膜的水化改變,破壞紅細胞膜對紅細胞MCV的調節作用,使紅細胞MCV增大,進而使紅細胞膜的脆性增大,變形能力變差,在通過脾竇毛細血管時易于被破壞而造成溶血[8]。我們認為正是這兩個原因,造成了HbCS復合HbH病患兒的臨床表現比缺失型HbH病患兒嚴重。臨床上正確區分HbH病類型對指導HbH病的治療與預后判斷非常重要。

分子生物學方法是檢測HbH病的金標準,雖然準確,但對實驗室條件要求高,對技術要求嚴格,實驗過程較復雜,不易進行質控,廣泛用于臨床檢測有一定的困難,國內大多數臨床醫院對HbH病的診斷多依靠電泳的方法。

由于HbCS屬于不穩定血紅蛋白,易于降解,應用血紅蛋白電泳的方法經常有漏診。HPLC是以物理化學原理為主的分離分析方法,分離率高,可把理化性質相差很小的混合物通過分離技術,使微小差異的各組分分離。在分離的同時,根據出峰位置可以定性,根據峰面積可以定量。靈敏度高,選擇性高,特別適用于生物大分子如各種血紅蛋白組分的分離,對HbH病及HbCS復合HbH病診斷的敏感性要遠高于電泳的方法[9]。且所需標本量少,標本無需前處理,操作簡單,能最大限度地消除人為誤差,數分鐘即可出結果,滿足了臨床上對缺失型HbH病與HbCS復合HbH病快速診斷的要求。

[1]趙永忠,徐湘民,楊 陽.應用溫度梯度凝膠電泳分析非缺失型α地中海貧血突變[J].中華醫學遺傳學雜志,2001,18:51.

[2]張之南,沈悌主編.血液病診斷及療效標準[M].科學出版社,第三版,2007,29-35.

[3]葉應嫵,王毓三,申子瑜主編.全國臨床檢驗操作規程[M].東南大學出版社,第3版,2006,186.

[4]周玉球,肖鴿飛,梁 雄,等.中國人3種常見缺失型α-地中海貧血的快速檢測及產前診斷[J].中國生育健康雜志,2003,14:30.

[5]Chan V,Yam I,Chen FE,Chan TK.A reverse dot-blot method for rapid detection of non-deletion alpha thalassemia[J].Br J Haemotol,1999,104:513.

[6]周玉球,肖奇志,黃麗娟,肖鴿飛,李文典,朱蘭芳等.HbH病患兒臨床表現與基因相關性的研究[J].中華兒科雜志,2004,42:693.

[7]Kanavakis E,Papassotiriou I,Karagiorga M,Vrettou C,Metaxotou-Mavrommati A,Stamoulakatou A,et al.Phenotypic andmolecular diversity of haemoglobin H disease:A Greek experience[J].Br J Haematol,2000,111:915.

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[9]Alla Joutovsky,Joan Hadzi-Nastic,Michael A.HPLC retention time as a diagnostic tool for hemoglobin variants and hemoglobinopathies:A study of 60000 samples in a clinical diagnostic laboratory[J].Clinical Chemistry,2004,50:1736.

The automated chromatography and clinical hematology analysis of hemoglobin H disease

ZHANG Li,OU Xiao-bing,YAN Mu-xia.(Department of Hematology,GuangZhou Children's Hospital,Guangzhou510120,China)

ObjectiveHemoglobin H disease(HbH)is the most severe type among survivors of αthalassemia.The aim of this study is to analyze the characterization of HbH disease in Gign performance liquid chromatography(HPLC)and clinical hematology and investigate the causes.MethodsForty-nine children with HbH disease or hemoglobin Constant Spring(HbCS)combined with HbH disease(HbH/CS)in GuangDong province were examined by using HPLC technique.All detailed clinical data of the caseswere recorded and all hematological findingswere evaluated.Results①In the HbH disease child,a HbH peak was present in the chromatogram and in the HbH/CS disease child,a HbH and a HbCS peak were present inthe chromatogram.Of these forty(nine children,thirty(eight(77.7%)were detected to be HbH disease and eleven(22.3%)were detected to be HbH/CS disease.②Comparedwith HbH disease children,HbH/CS disease children hadmarked spleen enlargement,thalassemic bone changes and severe anemia.Conclusion①Deletional type HbH disease was prevalent in these cases.HbH/CS disease demonstrated a characteristic HbCS peak in HPLC.②More severe clinical manifestation of HbH/CS disease children were related to significant higher HbH inclusion levels and the accumulation of α CS chains on the red blood cell membrane.

Hemoglobin H disease;High performance liquid chromatography;clinical manifestation

R331.1

A

1007-4287(2010)09-1417-03

廣州市衛生局科研基金(30307-2080050)

*通訊作者

2010-02-19)