犬外周血基質細胞的分離培養及其橫向分化潛能研究

韓 雪 劉洪臣 王東勝 蘇 方 孫 斌 吳 霞

骨髓基質細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)作為成體干細胞領域研究較多的一類干細胞，在細胞治療、基因治療及組織工程領域具有重要的臨床應用價值。但骨髓的抽取過程患者不易接受，而且數量極少，1×106個骨髓單個核細胞中僅有1個BMSC[1]，且隨著年齡的增加或體質的衰弱，細胞數量逐漸減少，使獲取大量的BMSCs受到限制。外周血來源的基質細胞(peripheral blood stromal cells，PBSCs)與BMSCs有很多相似的特性，同時又具有來源豐富、較易獲取、自體移植時無免疫排斥等諸多優點，日益突顯出在細胞治療和組織工程領域的優勢,具有廣泛的研究價值及廣闊的臨床應用前景。

目前，雖然對PBSCs的研究取得了一定的成果，但仍有許多問題有待于進一步闡明。例如，對細胞的生物學特性認識還不全面，如何有效獲取以及其體內、體外的分化潛能尚需要更多研究結果的證實。鑒于此，本實驗以犬為研究對象，對PBSCs的分離培養、橫向分化潛能進行系統性研究，從而為其作為種子細胞的相關實驗研究奠定基礎。

1.材料與方法

1.1 實驗動物 成年雄性雜種犬1只，身體健康，體重約15kg，解放軍軍醫進修學院醫學實驗動物中心提供并飼養。

1.2 主要實驗試劑和設備 淋巴細胞分離液(天津灝洋生物技術有限公司)，α-MEM培養液、FBS、L-谷氨酰胺(美國Invitrogen公司)，胰蛋白酶(美國Amresco公司)，β-甘油磷酸鈉、胰島素、地塞米松、引哚美辛、IBMX、抗壞血酸(美國Sigma公司)，小鼠抗人CD34、CD105單克隆抗體(北京中杉金橋公司)，OPN抗體(美國Santa Cruz公司)，超敏鼠二步法檢測試劑(北京中杉金橋公司)。

CO2恒溫孵箱(美國Thermo Forma公司)，超凈工作臺(北京昌平凈化設備廠)，倒置相差顯微鏡(德國 Leica 公司)。

1.3 PBSCs的分離與原代培養[2]取成年犬，剪除前肢毛發，碘伏消毒，肝素化注射器穿刺入靜脈抽血，約15-20mL。用等量培養基稀釋，緩慢加入淋巴細胞分離液表面，離心20min。收集中間云霧狀的單個核細胞帶，α-MEM完全培養液重懸，清洗3次。以5×106/mL密度接種于6孔板，加入含10%胎牛血清的α-MEM完全培養液，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下于恒溫培養箱內培養，每隔3天進行換液。

1.4 傳代培養 PBSCs原代培養至貼壁細胞生長近融合后，傾倒培養液，PBS液漂洗兩次，加入0.25%的胰蛋白酶浸潤瓶底細胞，輕輕搖動培養瓶，使消化液流遍所有細胞表面。消化約1min后把培養瓶放置顯微鏡下觀察，發現胞質回縮，細胞間隙增大后，終止消化，按1∶2比例進行接種，置于培養箱中繼續培養，次日更換培養基一次，倒置顯微鏡下觀察細胞的生長增殖情況以及形態變化。

1.5 免疫細胞化學染色 取P4代PBSCs細胞消化，接種于預先放置蓋玻片的6孔板內，常規培養4天后，4%多聚甲醛固定20min，PBS代替一抗為空白對照，免疫細胞化學染色方法行CD34和CD105染色。

1.6 犬PBSCs的橫向分化

1.6.1 成骨誘導

取P4代PBSCs細胞消化，接種于預先放置蓋玻片的6孔板內，用普通完全培養液培養，分為實驗組和對照組。待細胞長到50%融合后，實驗組更換為成骨誘導液（10-8mol/L地塞米松，10 mmol/Lβ-磷酸甘油酸鈉，50mg/L抗壞血酸），對照組繼續用普通完全培養液培養。培養14天后，95%乙醇固定，免疫細胞化學染色觀察OPN表達情況；培養28天，茜素紅染色觀察礦化結節形成情況。

1.6.2 成脂誘導

取P4代PBSCs細胞消化，接種于預先放置蓋玻片的6孔板內，用普通完全培養液培養，分為實驗組和對照組。待細胞長到50%融合后，實驗組更換為成脂誘導液(1μmol/L地塞米松，10 mg/L胰島素，0.2 mmol/L吲哚美辛，0.5 mmol/L IBMX)培養，對照組繼續用普通完全培養液培養，倒置相差顯微鏡觀察誘導后的細胞形態變化及胞內脂滴形成情況。每 2-3天對細胞換液，10-14天后根據分化的情況用10%福爾馬林固定進行油紅O染色。

2.結果

2.1 倒置相差顯微鏡觀察 原代培養前 3天細胞多處于懸浮狀態，貼壁細胞少，形態以圓形或橢圓形為主。之后開始出現部分貼壁細胞，呈短梭形，分布不均。7天后貼壁細胞逐漸增多，細胞集落開始出現，部分細胞開始伸展成長梭形。13-16天時細胞集落擴大較明顯，細胞以梭形及多邊形為主(圖 1-a)。

原代培養成功的PBSCs細胞按1∶2的比例進行傳代培養，48-72小時后絕大多數細胞貼壁，PBSCs呈紡錘形生長，形態較原代時均一(圖1-b)，生長速度也較原代有所增快，約3-4天時再次傳代。此后的P2、P3代的純度變高。

2.2 細胞免疫化學染色結果 外周血基質細胞表達CD105(圖2-a)，不表達CD34(圖2-b)。

圖1-a 原代PBSCs培養至13天，細胞集落擴大較明顯，細胞以梭形及多邊形為主(×100)

圖1-b 傳代PBSCs，細胞生長旺盛，形態均一，多數細胞呈紡錘形(×100)

圖2-a 外周血基質細胞CD105染色陽性(×200)

圖2-b 外周血基質細胞CD34染色陰性(×200)

2.3 成骨誘導 成骨誘導培養14天可見細胞復層生長，局部增厚，細胞呈重疊生長，OPN免疫化學染色陽性(圖3-a)。培養28天茜素紅染色見深紅色斑塊，為鈣鹽特征性染色(圖3-b)。

圖3-a PBSCs成骨誘導14天，OPN染色胞漿可見棕黃色顆粒(×100)

圖3-b PBSCs成骨誘導28天，茜素紅染色(×100)

2.4 成脂誘導 PBSCs經成脂誘導液誘導10天左右有少量脂滴出現，14天脂滴量顯著增加，油紅O染色呈陽性(圖4)。

3.討論

本研究體外培養犬外周血基質細胞(PBSCs)，檢測其表面標志物及其橫向分化潛能，為后續研究提供理論依據。PBSCs較其他來源的基質細胞有可反復取材、方便、安全、不需麻醉、對病人造成痛苦少等優點，因此近年來被廣泛關注。

圖4 PBSCs成脂誘導2周，油紅O染色陽性(×100)

迄今為止，許多研究證實多種哺乳動物包括兔[3,4]、狗[5]、鼠[6]、馬[7,8]和人[6,9]的外周血都存在基質細胞。但也有一些研究沒有檢測到PBSCs[10,11]，分析其原因主要是因為外周血中的基質細胞含量極低，骨髓基質細胞占單個核細胞的總數的0.001%-0.01%[12]。與BMSCs相比，PBSCs細胞克隆形成率更低，小鼠約1/106單個核細胞，兔約1/107單個核細胞，而人僅1/108單個核細胞[6]，另外也與研究中所采用的原代培養方法(包括分離方法和培養基)、動物模型(包括種屬、年齡、體重以及預先進行動員情況)的選取有關。

由于基質細胞具有在塑料培養板上貼壁生長的特性，本實驗采用淋巴細胞分離液，利用密度梯度離心法并結合貼壁分離篩選法來分離純化外周血基質細胞，將兩者的優點結合起來，有效的避免了一些缺陷。所獲取的PBSCs在原代培養的5天左右開始出現部分貼壁細胞，呈短梭形。7天后貼壁細胞增多，細胞集落開始出現，部分細胞開始伸展呈長梭形。13-16天時細胞集落擴大明顯，細胞以梭形及多邊形為主(圖1-a)。可見PBSCs的細胞貼壁較晚，分離效率較骨髓明顯低下，這也是制約PBSCs臨床應用的主要原因。

目前對于間充質基質細胞的表面標志物尚無確定結論，大部分關于表型特征的描述是通過體外細胞培養的方法來獲得的。利用流式細胞儀的研究顯示，體外擴增的基質細胞的表面標志物具有非特異性，表達CD105,CD73,CD90,CD166,CD44和CD29[11]。而體外擴增的骨髓基質細胞則不表達造血細胞系和內皮細胞系的標志物CD14、CD31、CD34和CD45。與骨髓相同，外周血來源的單個核系統中也包含間質系與造血系兩大系統，其多向分化能力來源于間質系統的基質細胞，可在定向誘導條件下多向分化。PBSCs與BMSCs在表征上有許多共同點，Zvaifler等[2]從正常成年人外周血中成功分離出貼壁生長的外周血基質細胞，它們同樣不表達 CD45、CD14和 CD34，表達 CD105、vimentin、collagen I、BMP-RIA 和 BMP-RII。本實驗利用免疫細胞化學染色方法檢測CD34和CD105，結果顯示分離培養的細胞表達CD105，不表達CD34，證明該細胞屬間質系，同時隨著細胞的傳代，細胞進一步得以純化。

本文之所以使用“基質細胞(stromal cells)”，而沒有使用“間充質干細胞(mesenchymal stem cell)”，是由于并沒有進行單個細胞克隆基礎上的嚴格鑒定。而間充質干細胞是一個嚴格的概念，需要對細胞長期的自我更新能力和發育潛能進行嚴格鑒定。國際細胞治療協會給出了多潛能間充質基質細胞的定義[13]：經過一定技術手段純化和富集的含有間充質干細胞的混合貼壁細胞。并提出了多潛能間質細胞鑒定的最低標準[14]：(1)多潛能間充質基質細胞一定是標準培養條件下的貼壁細胞；(2)表達 CD105、CD73和 CD90，低表達或不表達CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19和HLA-DR；(3)在體外標準誘導條件下可分化成至少三種不同類型的細胞：成骨細胞、成脂細胞和成軟骨細胞。如果沒有按照上述標準嚴格鑒定，應稱為“基質細胞”[14]。因此本實驗分離培養的細胞稱之為“外周血基質細胞”。

茜素紅染色常被用來鑒定細胞的成骨能力，其原理是茜素紅染料可以與鈣離子結合形成深紅色的螯合物；OPN是重要的礦化組織非膠原基質蛋白，是成骨細胞分化的標志，在成骨細胞分化早期開始表達，礦化啟動后大量合成。油紅O染色的原理是使用油紅O的油溶性，對其它的細胞結構著色性差。

本實驗培養的PBSCs在體外經成骨誘導后使鈣離子能夠以鈣鹽的方式沉積下來，即鈣結節，茜素紅染色陽性；免疫細胞化學染色法對骨橋蛋白進行檢測，結果顯示，骨橋蛋白明顯表達。經成脂誘導后，細胞胞漿中有油滴形成，油紅O染色陽性。證明PBSCs具有向成骨、成脂方向分化的能力。

綜上所述，我們的實驗進一步證實從外周血中可分離培養出基質細胞，它們具有與骨髓基質細胞相似的特性與分化能力，能向成骨細胞和成脂細胞分化，有望成為細胞治療或組織工程的種子細胞來源。

[1]呂春榮,葉紹輝,馬月輝,等.骨髓間充質干細胞及其應用[J].中國畜牧獸醫，2009，36(4)：114-118

[2]Zvaifler NJ,Marinova-Mutafchieva L,Adams G,et al.Mesenchymalprecursor cellsin the blood ofnormal individuals[J].Arthritis Res,2002,2(6)：477-488

[3]Wan C,He Q,Li G.Allogenic peripheral blood derived mesenchymal stem cells(MSCs)enhance bone regeneration in rabbit ulna critical-sized bone defect model[J].J Orthop Res，2006，24(4)：610-618

[4]劉世森,蘇 方,劉洪臣,等.外周血作為骨組織工程種子細胞來源的初步研究[J].口腔頜面修復學雜志，2009,10(3)：132-135

[5]Huss R,Lange C,Weissinger EM,et al.Evidence of peripheral blood-derived,plastic adherent CD34(-/low)hematopoietic stem cell clones with mesenchymal stem cell characteristics[J].Stem Cells，2000,18(4)：252-260

[6]Kuznetsov SA,Mankani MH,Gronthos S,et al.Circulating skeletal stem cells[J].J Cell Biol，2001，153(5)：1133-1140

[7]Koerner J,Nesic D,Romero JD,et al.Equine peripheral blood-derived progenitors in comparison to bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J].Stem Cells，2006,24(6)：1613-1619

[8]Giovannini S,Brehm W,Mainil-Varlet P,et al.Multilineage differentiation potential of equine blood-derived fibroblastlike cells[J].Differentiation，2008,76(2)：118-129

[9]Tondreau T,Meuleman N,Delforge A，et al.Mesenchymal stem cells derived from CD133-positive cells in mobilized peripheralblood and cord blood：proliferation, Oct4 expression,and plasticity[J].Stem Cells， 2005， 23(8)：1105-1112

[10]Lazarus HM,Haynesworth SE,Gerson SL,et al.Human bone marrow-derived mesenchymal(stromal)progenitor cells(MPCs)cannot be recovered from peripheral blood progenitor cell collections[J].J Hematother,1997， 6(5)：447-455

[11]Wexler SA,Donaldson C,Denning-Kendall P,et al.Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal‘stem’cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not[J].Br J Haematol，2003,121(2)：368-374

[12]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential ofadulthuman mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284(5411)：143-147

[13]Horwitz EM,Le Blanc K,Dominici M,et al.Clarification of the nomenclature for MSC：The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy,2005，7(5)：393-395

[14]Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy，2006，8(4)：315-317