3-硝基丙酸預處理對大鼠腦組織缺血-再灌注損傷的保護作用與神經細胞骨架蛋白的相關性研究

周春奎, 胡雪峰, 趙 騰, 常 明, 張海寧

有報道稱[1],對大鼠進行小劑量 3-硝基丙酸(3-nitropropionic acid,3-NPA)預處理不但不會產生神經組織學損傷,反而對再次發生的局灶性腦缺血產生耐受性,此現象的機制已成為研究熱點。目前,在蛋白質組學水平研究 3-NPA對腦缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)的保護機制尚未見報道。本實驗采用 Zea Longa的大腦中動脈線栓法并加以改進,建立局灶性腦缺血-再灌注模型,以小劑量 3-NPA對預處理組大鼠進行干預,應用差異蛋白質組學結合質譜鑒定找出預處理組與對照組差異表達的神經細胞骨架相關蛋白,通過對存在差異的神經細胞骨架蛋白進行功能分析,為進一步探討 3-NPA預處理在 IRI后產生的腦保護作用提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料 CyDye花青素熒光染料(Cy2,Cy3,Cy5)、24cm固相 pH梯度干膠條(Immobilized pH gradient,IPG,pH 4～ 7)、CHAPS、兩性電解質 (pharmalyte,p H 3～10)、二硫蘇糖醇 (DTT)、碘乙酰胺(IAA)、尿素、丙烯酰胺、甘氨酸、Tris、SDS、Clean-up試劑盒購自 GE Healthcare-Amersham Biosciences(Uppsala,Sweden);L-谷氨酰胺和 3-NPA購自 Sigma Aldrich(Saint Louis,USA)。

1.2 儀器 IPGphor II等電聚焦儀、DALTSix電泳系統、Typhoo9400系列多功能激光掃描成像系統、DeCyder差異分析軟件和 MALDI-TOF質譜均為GE Healthcare-Amersham Biosciences公司產品。

1.3 動物及分組 雄性 Wistar大鼠 20只,體重 250～300g,由吉林大學基礎醫學院實驗動物中心提供及飼養。隨機分組:(1)生理鹽水 +缺血再灌注組(對照組);(2)3-NPA預處理 +缺血再灌注組(預處理組)。3-NPA濃度為 4mg/ml,實驗前用雙蒸水新鮮配制,用 NaOH調節 pH至 7.4。預處理組大鼠腹腔注射 3-NPA(20mg/kg),對照組腹腔注射等體積生理鹽水,于 72h后分別制作腦缺血-再灌注模型。

1.4 大腦中動脈缺血-再灌注模型制備 采用Zea Longa的大腦中動脈線栓法(MCAO)并加以改進,建立局灶性腦缺血-再灌注模型,大鼠術后 2h完全清醒、神經功能障礙評分達 3分、且再灌注 72h后未死亡的動物納入實驗。

1.5 蛋白質樣品的制備 大鼠術后分別于72h腹腔內注射 10%水合氯醛麻醉,快速斷頭處死,冰上剝離左側大腦,用預冷超純水沖洗腦組織中殘留血液,取梗死病灶側大腦皮層約 100mg(濕重),放入研缽內,加入提取裂解液 500μl,同時加入 1%核酸酶和 1%蛋白酶抑制劑,混勻,冰浴研磨勻漿,研磨時避免產生氣泡。室溫變性作用 60min,然后15℃,25000r/min離心 30min,收集上清液。蛋白樣品參照 2D Clean-up試劑盒說明書去除雜質。用Bradford法測定蛋白質樣品濃度。

1.6 CyDye熒光染料標記蛋白質樣品 將各樣品 pH值調至 8.5,每份樣本 50μg避光條件下加入 1μl(400pmol/L)的 CyDye(Cy3、Cy5、Cy2)熒光工作液,其中 Cy2標記 20個樣本各 25μg組成的混合物作為內標,具體標記情況如表1所示。參照 Skynner法避光冰浴 30min后,加入 1μl 10mmol/L賴氨酸終止反應。

表1 DIGE膠內樣品分組及組成

1.7 熒光差異雙向凝膠(DIGE)電泳制備 分別混合標記后的 3塊膠樣品及內標,用重泡漲液(7mmol/L尿素,2mmol/L硫脲,4%CHAPS,1%IPG buffer,40mmol/LDTT,痕量溴酚藍)定容至 450μl。在 20℃,用 IPGphorⅡ等電聚集儀,將 24cm IPG膠條水化重泡漲 6h,按表2所示參數進行等電聚集電泳。等電聚焦(參數見表2)后,將膠條分別放置在含 2%DTT和 4%IAA的平衡液中各振蕩平衡 15min,再移至 12.5%的 SDS-PAGE膠(24cm×20cm×1.0mm)上端,酸性端旁置蛋白分子量標志,20℃在 DALTSix電泳儀中 40mA恒電流電泳,直至溴酚藍到達膠的底端。用 Typhoon 9400成像系統掃描雙向電泳凝膠,各熒光染料的激發光和發射光波分別為:Cy2,480nm和 530nm;Cy3,540nm和 590nm;Cy5,620nm和 680nm。掃描后的圖像文件用 DeCyder5.0版本軟件分析,應用 BVA模式進行膠與膠之間匹配,不同組間選擇 Student檢驗和單因素方差分析(One-Way ANOVA)。挑選出兩組間具有統計學意義(P＜0.05)的顯著增加或者顯著減少的感興趣差異蛋白點。

表2 等電聚焦電泳參數

1.8 質譜分析及蛋白質鑒定 取對照組及預處理組蛋白樣品各 800μg,按常規方法進行制備膠雙向電泳后,經考馬斯亮藍染色,用 Ettan Spot Picker(Amersham Biosciences)機器人挖取與感興趣差異蛋白相匹配的蛋白點。參照 Wilm方法,對所挖取的蛋白點用 50%乙腈沖洗,胰蛋白酶消化,以 Ettan Spotter(Amersham Biosciences)在靶條上進行樣品點樣后,應用基質輔助激光解析/電離-飛行時間(MALDI-TOF)質譜分析蛋白質肽質量指紋譜,并將結果輸入 NCBI和 Swiss-Prot蛋白質數據庫進行檢索。

2 結 果

2.1 DIGE比較各組大鼠腦組織蛋白質差異分析 經 DeCyder-DIAV5.0軟件分析 Cy2、Cy3、Cy5染色的內標和對照組及預處理組的 3塊膠,結果可見兩組間膠上的蛋白點分布模式基本一致,每塊膠上平均含有 2668個蛋白點,其中可匹配的蛋白點 2080個。應用 DeCyder-BVA軟件分析蛋白質表達量差異,發現 72h預處理組與對照組相比有 52個蛋白點表達量顯著改變(見圖1)。

2.2 差異蛋白質點的質譜鑒定和數據庫檢索通過質譜分析及數據庫檢索鑒定出3-NPA預處理組與對照組之間存在明顯差異的蛋白質有 15種,其中神經細胞骨架相關蛋白 7種,具體如下:ERM家族蛋白(ezrin蛋白、radixin蛋白和 moesin蛋白)、神經細絲蛋白輕鏈多肽(neurofilament light polypeptide,NF-L)、神經細絲蛋白中鏈多肽(neurofilament medium polypeptide,NF-M)、二氫嘧啶酶相關蛋白 2(dihydropyrimidinase-related protein 2,DRP-2)、巢蛋白(nestin),以上 7種蛋白預處理組較對照組表達均顯著增高(見表3)。

表3 神經細胞骨架相關蛋白鑒定結果

圖1 制備膠圖像顯示差異表達的蛋白,綠圈內為 3-NPA預處理組與 IRI組的差異表達點

3 討 論

缺血-再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)是指各種原因造成局部組織器官缺血,使組織細胞發生缺血性損傷,當在一定條件下恢復血液再灌注后,組織細胞的代謝功能障礙及結構破壞未減輕反而進一步加重。IRI往往引起較缺血本身更為嚴重的損害,導致各種神經功能缺損的癥狀,其機制較多,目前公認的有氧自由基、鈣超載、炎癥反應等[2]。細胞骨架蛋白主要功能是維持真核細胞的空間結構,包括微管、微絲或肌動蛋白絲以及中間絲 3種類型。越來越多的事實證明,對細胞骨架的保護在腦損傷恢復中具有重要的意義。細胞骨架的研究將成為缺氧缺血性腦損傷研究的熱點。

預適應(preconditioning)是指一次或多次短暫、非致命性刺激后,機體、組織或細胞能對其后一段時間內嚴重、甚至致命性損傷產生一定程度耐受的現象,其機制包括低氧誘導因子生成、基因表達的上調等[3]。近年來研究發現,一些藥物或化學預處理可以誘導腦組織產生保護作用,稱為藥理性預適應。3-NPA是琥珀酸脫氫酶抑制劑,其進入機體后與琥珀酸脫氫酶共價結合,抑制線粒體電子傳遞和氧化磷酸化過程,阻斷呼吸鏈,引起組織缺氧。Wiegand等[1]報道,小劑量 3-NPA(20mg/kg)預處理不足以產生神經組織學損傷,反而對再次發生的嚴重局灶性腦缺血缺氧產生耐受性。3-NPA預處理具有時間依賴性,預處理后 3～24h即產生效應,持續 1～4d,以預處理后 3d效應最佳。Riepe等[4]發現在大鼠腹腔注射 3-NPA 20mg/kg預處理后 1d,腦海馬切片耐受缺血能力明顯提高,神經元密度增加約 50%。此外有研究將體外培養的皮層神經元用 3-NPA預處理,發現預處理后數小時至 2d這些神經元抗缺氧能力明顯增強。目前認為,3-NPA預處理后可以激活機體自身內源性保護機制,提高神經元對缺血缺氧的耐受性,提高腦組織的抗損傷能力。本實驗應用差異蛋白質組學技術,鑒定了 3-NPA預處理組大鼠與IRI組大鼠之間存在差異的蛋白質 15種,其中神經細胞骨架相關蛋白 7種。

3.1 REM蛋白家族 ERM蛋白家族(ezrin/radixin/moesin)是連接皮層細胞骨架與質膜上整合膜蛋白的橋梁分子,其通過介導細胞質膜與肌動蛋白等細胞骨架的連接,在細胞的生長、運動、遷移、有絲分裂以及信號轉導等方面發揮重要作用[5]。在神經系統中,ERMs蛋白主要表達于新皮層的中間帶,這個區域密集了遷移的神經元和生長的軸突。在皮層形成過程中,ERMs是主要的細胞骨架連接器,在神經元遷移和軸突延伸過程中發揮重要的功能[6]。有實驗表明,在培養的原代神經元細胞中抑制 ERMs的表達,可抑制生長錐和神經元軸突的形成[7]。由此可知 ERMs在維持神經細胞結構及促進軸突生長方面具有重要的生物學作用。

3.2 神經細絲蛋白輕鏈多肽(NF-L)及中鏈多肽(NF-M) 神經細絲蛋白(neurofilament protein,NFP)是神經細胞特異蛋白,屬于中間絲。NFP廣泛的分布在神經細胞的細胞質、神經突起內。脊椎動物的 NFP是由分子量 70kD(L)、145kD(M)、200kD(H)三種不同的蛋白亞基組成的,神經細絲蛋白輕鏈多肽(neurofilament light polypeptide,NF-L)亞基出現最早并構成 NF的核心,神經細絲蛋白中鏈多肽(neurofilament medium polypeptide,NF-M)及神經細絲蛋白重鏈多肽(neurofilament heavy polypeptide,NF-H)亞基通過 NF-L亞基構成螺旋狀三聯體,維持神經細胞骨架的維持。另外,NFP多肽由細胞質產生、通過順行性慢速軸索流向終末,參與物質運輸[8]。由此可知,NF-L和 NF-M表達增高可通過維持神經元細胞功能及加速軸漿運輸,起到神經保護的功能。

3.3 二氫嘧啶酶相關蛋白 2(DRP-2) DRP-2參與腦組織的細胞骨架組成[9],是一種參與神經分化與軸突形成的蛋白,與軸突的生長和可塑性密切相關。另有研究顯示[10],在卒中后的皮層和紋狀體的缺血半暗帶區的肥大細胞中 DRP-2 mRNA表達明顯上調,參與缺血時神經元的細胞防御機制。目前認為,缺血可激活中樞神經系統的潛在的破壞性和保護性蛋白質的合成,而 DRP-2即是一種神經系統缺血時的保護性蛋白。

3.4 巢蛋白 巢蛋白(nestin)是一種新近發現的中間絲蛋白,屬于細胞骨架蛋白,是神經干細胞特異性標志物[11]。這種蛋白在哺乳動物胚胎期 CNS的神經前體細胞內大量表達,動物出生后其表達很快降低并消失。但在少數仍保持神經發生功能的部位(如大腦室管膜下區、嗅球、海馬齒狀回)仍有表達。有研究證明,成熟的神經元是巢蛋白陽性細胞的基礎,在損傷后被誘導表達,其中在迷走、喉返神經損傷后,疑核中的神經元可能有更新的潛力[12]。腦缺血性損傷時,腦室下區和海馬齒狀回巢蛋白細胞表達增加,在缺血中心區和周邊區如紋狀體、皮質、海馬也出現表達增高。目前巢蛋白已經廣泛用于神經干細胞的鑒定,巢蛋白的高表達預示著神經干細胞的激活。腦缺血時,缺血區神經元壞死或凋亡,激發非供血區已成熟神經元重返胚胎神經上皮細胞特征并分泌巢蛋白,作為適應缺血性腦損傷的一種代償性反應,或者缺血激活非缺血區腦實質內處于靜息狀態的神經干細胞,向神經元方向分化,遷徙到缺血區以補充神經元的不足。

綜上所述,通過差異蛋白質組學研究,根據各種蛋白的特性,考慮 3-NPA預處理的神經保護機制可能涉及 ERMs蛋白家族、神經細絲蛋白、二氫嘧啶酶相關蛋白 2等細胞骨架相關蛋白的調節表達,通過維持神經細胞結構及促進軸突生長,加速軸漿運輸,促進神經干細胞激活并定向分化成神經元,最終增加腦組織對缺血-再灌注的耐受性,起到腦保護作用。

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