芪棱湯對腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障通透性及基質金屬白酶－3表達的影響＊

周榮峰

芪棱湯對腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障通透性及基質金屬白酶－3表達的影響＊

周榮峰

目的觀察芪棱湯對腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障通透性及基質金屬蛋白酶－3(MMP－3)表達的影響。方法將大鼠隨機分為假手術組、模型組、芪棱湯去養陰藥組(對照組)及芪棱湯組(治療組)。采用頸內動脈線栓法復制大鼠腦缺血再灌注(MCAO/Reperfusion)模型。通過測定滲出血管外的伊藍(EB)含量來評價血腦屏障通透性的變化，在再灌注不同時點采用免疫組織化學法檢測MMP－3的表達。結果在再灌注各時間點，治療組、對照組與模型組比較均有顯著差異，治療組、對照組EB滲出量、MMP－3表達少于模型組;治療組與對照組有顯著差異，治療組EB滲出量、MMP－3表達少于對照組。結論芪棱湯對腦缺血再灌注后的保護作用，其機制可能與通過抑制MMP－3表達保護血腦屏障有關。

腦缺血再灌注損傷 芪棱湯 血腦屏障 基質金屬蛋白酶－3

廣東省深圳市寶安區石巖人民醫院(深圳518108)

＊廣東省深圳市科技計劃非資助項目(No.200903189)

缺血再灌注損傷是一個復雜的、多因素參與的過程，血腦屏障的完整性在腦缺血再灌注損傷的病理生理過程中起著重要的作用。缺血后再灌注將導致血腦屏障嚴重破壞，從而促發明顯的腦水腫和梗死。大量研究證實，蛋白酶是導致缺血再灌注損傷的主要因子。本實驗通過觀察芪棱湯對腦局灶性缺血再灌注后血腦屏障通透性的變化和基質屬蛋白酶－3(MMP－3)表達的影響，進一步闡明芪棱湯抗腦缺血再灌注損傷機制。

1 材料與方法

1.1 材料 動物:SD雄性大鼠126只，SPF級，體質量(300±30)g，月齡4個月左右。由廣東省醫學實驗動物中心提供，合格證號:2007A010。試藥:芪棱湯精制液(黃芪、桑椹、天花粉、三棱、莪術、枳殼、豨薟草、水蛭)，芪棱湯去養陰藥精制液，均由深圳市人民醫院制劑中心提供;伊藍(EB)、MMP一3兔多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 分組 126只SD大鼠隨機分為芪棱湯組(治療組)、芪棱湯去養陰藥組(對照組)、模型組，每組40只，假手術組6只，前3 組每組又分為缺血 3h 再灌注 6、12h、1、3、7d 5 個亞組，各亞組每組8只。

1.3 給藥 各組在實驗前7d灌胃相應藥物，治療組灌服芪棱精制液，對照組給予芪棱湯去養陰藥精制液，每次20mL/kg，其余兩組予等劑量生理鹽水。每12小時給藥1次，每日2次，直至處死。采用盲法給藥，給藥由專人負責，造模者回避。

1.4 造模方法 造模方法采用在Zea longa[1]基礎上改良的頸內動脈線栓加環扎法。

1.5 血腦屏障通透性評價 各組大鼠均在處死前30min通過尾靜脈注射2%EB 2mL/kg，用甲酰胺浸泡法[2]測量腦組織中的EB含量。建立EB標準曲線，求出各標準管相應的光密度值(X)與EB含量(Y)的直線回歸方程:Y=11.33 X－0.347。取缺血灶周圍約0.4g腦組織標本，稱取質量后放人盛有4mL甲酰胺的試管中，加上橡皮塞，45℃水浴24h，加溫數小時后用一根細棒將浮在上面的腦組織輕輕加壓后使其下沉，使腦組織中EB能充分溶解出來。水浴24h后用吸管輕輕吸出上清液，然后比色測光密度值。腦組織EB含量(μg/g)=A×甲酰胺量(mL)/腦濕質量(g)，A為根據標準曲線回歸方程求得的樣本EB含量，單位為μg/mL。

1.6 免疫組織化學方法檢測MMP－3表達 各組在再灌注的各時間點取動物，斷頭處死，以視交叉為中線取約4mm厚的腦組織，平分切成2mm厚的腦片，置于4%多聚甲醛中固定。常規石蠟包埋，切片，片厚4μm。。切片收集于0.01mol/L PBS液內，用多克隆兔抗MMP－3抗體，采用漂浮法對其進行免疫組織化學染色。MMP－3陽性表達為細胞質染色，陽性染色為棕黃色，正常細胞呈綠色。

2 結果

2.1 各組腦組織EB滲出量 見表1。假手術組可見極少量EB滲出。模型組在再灌注6h腦組織EB滲出量增加，可見損傷區藍染較正常區域顏色深，再灌12h腦組織EB滲出量逐漸增加，再灌注1d腦組織EB滲出量達到高峰，再灌注3d以后逐漸減小。對照組、治療組與模型組表達規律一致。在再灌注6、12h、1、3、7d，治療組、對照組與模型組比較差異均有統計學意義(P＜0.01)，治療組、對照組EB滲出量少于模型組(P ＜0.01);治療組EB滲出量少于對照組(P ＜0.01)。

表1 各組再灌注各時間點腦組織EB含量變化 (μg/g，±s)

與模型組比較，＊P ＜0.01;與對照組比較，△P ＜0.01。下同

組別假手術組模型組對照組治療組6h 0.20 ± 1.04 1.62 ± 1.04 0.92 ±2.63＊0.38 ±0.99＊△12h－2.15 ±0.57 1.31 ±1.31＊0.81 ±1.38＊△1d－3.13 ±1.53 2.32±1.76＊1.46 ± 0.08＊△3d－2.56 ±1.81 1.73 ±2.01＊0.83 ±1.17＊△7d－1.65 ±0.57 0.91 ±1.33＊0.26 ±1.82＊△

2.2 各組MMP－3表達的動態變化 見表2。MMP－3在小膠質細胞、缺血神經元、內皮細胞、中性粒細胞中表達，免疫陽性細胞呈現淡棕黃色。假手術組可見微弱MMP－3表達。模型組再灌注6h即有表達，1d明顯增多，3d達到高峰，以后逐漸下降。對照組、治療組與模型組表達規律一致。再灌注 6、12h、1、3、7d，治療組、對照組與模型組比較差異均有統計學意義(P＜0.01)，治療組、對照組MMP－3表達少于模型組 (P＜0.01);治療組MMP－3表達少于對照組(P ＜0.01)。

3 討論

缺血性腦梗死屬于中醫學“中風”的范疇，歷代醫家對中風有不同的看法，提出了許多不同的治療方法。自清代王清任提出“氣虛血瘀”理論，將補氣藥及活血化瘀并用，創補陽還五湯后，中醫學對缺血性腦梗死的治療多從“氣虛血瘀”角度出發采用益氣活血法。而對“津血同源”、“陰虛致瘀”的理論認識運用不足。本課題在“津血同源”、“陰虛致瘀”等理論的基礎上，給合多年臨床經驗提出了“氣陰兩虛、瘀血阻絡”是缺血性腦梗死的又一重要病機，并在此基礎上根據“增水行舟”的理論[3]，創立益氣養陰活血方劑芪棱湯。本方重用黃芪大補脾胃之元氣，令氣旺血行，瘀去絡通，為君藥;桑葚、天花粉滋陰生津，增液以行舟，令氣行血運為臣藥;三棱、莪術、枳殼、豨薟草活血祛瘀，水蛭通經活絡，均為佐藥。本方配伍特點為大量補氣藥與滋陰藥相配，并佐以少量活血藥，共起補氣養陰活血之功。芪棱湯用于臨床治療腦梗死等缺血性腦血管病，取得令人滿意的療效[4－6]。

神經細胞、膠質細胞、微血管內皮細胞間的相互依存關系是組成和維持腦功能及結構的必要條件，血腦屏障參與血腦物質交換的調節，而神經元的直接生存微環境是神經元和膠質細胞間的細胞間液，即細胞外基質(ECM)[7]。腦組織中ECM是維持血腦屏障結構完整性的重要組成部分，其中基底膜尤為重要。它由ECM分子如Ⅳ型膠原、層黏蛋白和纖維連接蛋白構成，為血管的完整性提供結構支持[8]。MMPs是一組含鋅酶的基因家族，能降解基底膜成分，導致血腦屏障的破壞，參與到神經系統炎癥的反應中。MMP－3的底物包括膠原(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ、Ⅹ型)、纖維連接蛋白、層黏連蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖等幾乎全部的ECM成分，是一種重要的調節ECM的蛋白酶。Falo等[9]報道MMP－3可以通過重構細胞外基質，促進突觸重建，調節腦損傷修復。

本研究發現，在再灌注 6、12h、1、3、7d，治療組、對照組與模型組比較差異均有統計學意義，治療組、對照組MMP－3表達、EB滲出量明顯少于模型組;治療組MMP－3表達、EB滲出量明顯少于對照組。提示芪棱湯可能通過抑制MMP－3的活化介導的血腦屏障的破壞，進而減輕腦缺血再灌注損傷，且芪棱湯優于芪棱湯去養陰藥湯，即益氣養陰活血法優于益氣活血法。

表2 各組再灌注各時間點MMP－3陽性細胞計數(個/視野，±s)

表2 各組再灌注各時間點MMP－3陽性細胞計數(個/視野，±s)

組別假手術組模型組對照組治療組6h 1.13 ±0.76 8.82 ± 1.42 5.21 ±1.03＊2.08 ±0.44＊△12h－12.15 ± 0.97 8.33 ±0.74＊5.21±1.01＊△1d－19.21 ± 1.38 14.35 ± 1.76＊11.03±0.68＊△3d－21.56 ± 0.81 17.03 ± 1.17＊13.41±1.07＊△7d－15.33 ± 1.07 10.16 ±1.33＊5.73 ±0.82＊△

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Effect of Qileng Decoction on the Blood-brain Barrier Permeability and the MMP-3 Expression in Rats with Cerebral Ischemia Reperfusion

ZHOU Rong-feng
Shiyan People’s Hospital， Baoan District， Shenzhen City， Guangdong Province(Shenzhen 518108)

Objective:To study the effect of Qileng Decoction on the blood-brain barrier permeability and the MMP-3 expression in rats with cerebral ischemia reperfusion.MethodsRats were randomly divided into the sham-operation group， the model group， the control group and the treatment group.The control group was given Qileng Decoction without nourishing yin herb.The treatment group was used Qileng Decoction.The MCAO model was established by the method of internal carotid artery occlusion by suture.The variation of the blood-brain barrier permeability was detected by the EB content exudation vascular.The MMP-3 expressions in different time points were detected by the immunohistochemistry method.ResultsIn different reperfusion time points， there were some significant differences in the treatment group， the control group and the model group.The EB exudation content and the MMP-3 expression of the treatment group and the control group were lower obviously than those of the model group.There was a remarkable difference between the treatment group and the control group.The EB exudation content and the MMP-3 expression of the treatment group were lower significantly than those of the control group.ConclusionThe mechanism of that Qileng Decoction could protect the function after cerebral ischemia reperfusion could be related to its inhibition the MMP-3 expression to protect the blood-brain barrier.

Cerebral ischemia reperfusion injury;Qileng Decoction;Blood-brain barrier;MMP-3

R285.5

A

1004－745X(2010)09－1554－03

2010－03－08)