載脂蛋白E基因多態性與血管性認知障礙關系的研究

楊豐兵,李新毅,穆俊霞

載脂蛋白E(Apo E)基因位于19q13.2上,3種常見的等位基因ε 2、ε 3和ε 4分別編碼產生3種主要的Apo E異構體 Apo E2、Apo E3和Apo E4[1]。Apo E參與機體血脂代謝及調節膽固醇平衡,在動脈粥樣硬化的發生和神經損傷的修復中起著重要作用[2],它與血管性認知障礙的關系目前研究很少,有必要對腦梗死病人Apo E基因多態性進行研究,并分析其對認知功能障礙的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取山西醫科大學第一醫院2009年5月—2009年11月新入院的腦梗死病人240例為腦梗死組,其中男139例,女101例,年齡(67.65±7.86)歲。診斷符合全國第四屆腦血管病學術會議修訂的診斷標準[3],并經頭顱CT/磁共振成像(M RI)確診;排除栓塞性、感染性因素及其他非血管因素所致卒中,另外除外意識障礙、失語及有精神障礙不能配合認知功能檢查的病例。并同期收集山西醫科大學第一醫院門診體檢中心健康體檢者150名作為對照組。其中男92名,女58名,年齡(65.38±7.36)歲。兩組年齡、性別差異無統計學意義。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采集空腹靜脈血2 mL,用EDTA-Na2抗凝,用DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2.2 引物設計 參照文獻[4]方法,用等位基因特異性多重聚合酶鏈反應(ARMS-PCR)方法檢測ApoE基因多態性。設計上游引物序列(由寶生物工程大連有限公司合成):P1,5′-CGCGGACATGGAGGACGT TT-3′,P2,5′-CGCGGACATGGAGGACGT TC-3′,分別檢測 ApoE112位的半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg);P3,5′-ATGCCGATGACCTGCAGAATT-3′,P4,5′-ATGCCGATGACCTGCAGAATC-3′,分別 檢測 ApoE158位的 Cys和 Arg;設 計 公 共 下 游 引 物 為 P5,5′-GTTCAGTGATTGTCGCTGGGCA-3′;引物 P1與 P5、P2與 P5擴增出的片段為588 bp,P3與P5、P4與 P5擴增出的片段為451 bp。另按照 Newton等[5]方法,設計一對引物擴增α-抗胰蛋白酶(AAT)基因外顯子3片段(360 bp),作 為內參照。序列:P6,5′-CCCACCTTCCCCTCTCTCCAGGCATGGg-3′,P7,5′-GGGGCCTCAGTCCCAACATGGCTAAGAGG-3′。

1.2.3 PCR反應體系 總反應體系為25 μ L,每個樣本設計1、2、3、4四管。各管均加入10×PCR Buffer(含 18 mmol/L Mg2+)2.5 μ L,5 mmol/L dNTP 2 μ L,Taq DNA 聚合 酶 4 U,DNA 模板 3 μ L,二甲基亞砜(DMSO)2 μ L,公共引物 P5 1 μ L,P6和 P7 各 1 μ L,每管分別加入對應的 P1、P2、P3、P4 1.5 μ L,最后加滅菌三蒸水 11 μ L。

1.2.4 PCR反應條件 95℃預變性5 min,然后按 95℃變性45 s、62℃退火 45 s、72℃延伸45 s,循環 35次,最后 72℃延伸5 min。取 10 μ L PCR產物和6*buffer 2μ L混合后,用濃度為2%的瓊脂糖凝膠(已加入goldview)進行電泳后、凝膠成像系統進行圖像分析,確定ApoE基因型。電泳條件:0.5×TBE電泳緩沖液恒壓100 V電泳30 min。

1.2.5 結果判定方法 每個樣本分別設計 1、2、3、4四管,均加入公共下游引物P5,并分別加入上游引物 P1、P2、P3、P4。P1與 P5擴增出 588 bp片段,決定ApoE 112的Cys;P2與 P5擴增出 588bp片段,決定112位Arg;P3與 P5擴增出451 bp片段,決定158位Cys;P4與P5擴增出451 bp片段,決定158位Arg。E2/2型第112、158位均為 Cys,故 1、3管擴增陽性,而2、4管除擴增出360bp內參AAT片段外,無目的片段擴增出;E3/3型第112位是Cys、第158位是Arg,故 1、4管擴增陽性,而2、3管只擴增出360 bp內參片段;E4/4型第112、158位均是Arg,故2、4管擴增陽性,1、3管只擴增出360 bp內參片段;E2/3型1、3、4管擴增陽性,2管只擴增出 360 bp內參片段;E3/4型1、2、4管擴增陽性,第3只擴增出 360 bp內參片段;E2/4型1、2、3、4 管均擴增陽性。

1.2.6 認知功能測評 所有腦梗死病人病情穩定后均進行MM SE及MOCA量表測評。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行分析,基因頻率采用基因計數法,基因型及等位基因頻率比較用χ2檢驗。3個基因亞型間評分的比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 ApoE基因各基因型及等位基因分布 ACI組ApoE3/4基因型頻率較對照組顯著增高(P＜0.05)。ACI組和對照組間等位基因頻率有統計學意義(P＜0.05),腦梗死組ε 4頻率高于對照組(P＜0.05)。詳見表 1。

表1 APOE基因型及等位基因分布 例(%)

2.2 腦梗死組不同ApoE基因亞型M MSE、MOCA評分的比較(見表2)

表2 各APOE基因亞型間MMSE、MOCA比較(±s) 分

表2 各APOE基因亞型間MMSE、MOCA比較(±s) 分

組別 MMSE評分 M OCA量表ε 2 組 27.90±1.101) 26.69±1.311)ε 3 組 24.32±5.951) 23.89±5.031)ε 4 組 20.07±9.23 19.83±10.75與ε 4比較,1)P＜0.05

3 討 論

Apo E是載脂蛋白家族中重要的成員之一,它參與人體脂代謝調節,與動脈粥樣硬化甚至高血壓的發生有關。而高脂血癥、動脈粥樣硬化、高血壓病等又是腦血管病的危險因素[6,7]。ApoE在脂蛋白的代謝中起著重要作用,ε 4等位基因與高含量的血總膽固醇(TC)、高濃度的低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)以及高水平的載脂蛋白B顯著相關,促進動脈粥樣硬化。本實驗Apo E4基因在腦梗死組比在對照組有較高的表達率,與大多研究相一致。腦梗死組中ε 4頻率明顯高于對照組,推斷ε 4等位基因可能是腦梗死的遺傳標記之一。

血管性認知障礙(VCI)是指由血管因素引起的不同程度的認知障礙[8]。目前已知ApoE4基因型是阿爾茨海默氏病(AD)發病的易感和危險因素之一[9]。本研究顯示ApoEε 4基因攜帶者認知功能(MMSE及 MOCA評分)明顯低于ε 2、ε 3攜帶者。與我國流行病學調查顯示攜帶ApoEε 4基因的健康老年人隨著年齡的增加更易出現認知功能的障礙相一致。因此,可以推測ApoEε 4基因為 VCI的危險因素,但其導致認知功能下降的機制可能不單純是增加血管性風險,還有其他機制,如對神經元損傷后修復的影響。

ApoE是神經系統中髓鞘磷脂代謝重要因子,而髓鞘磷脂代謝與神經元損傷后的修復過程密切相關。缺血性及創傷性所致的神經變性和再生時,星形細胞或臨近巨噬細胞釋放ApoE量增加 ,促進膽固醇酯化從而為軸突膜的生長提供脂質,利于神經元的生長及神經樹突重建。而這一作用被證實是E3單體特異性的,而E4卻無此特異作用[10]。E4可能會加重神經變性或血管性原因造成的腦損傷修復困難,從而在認知障礙的發生中起消極作用。ApoE4基因可能為VCI的危險致病因子,但具體作用機理尚待進一步研究。

但是,ApoEε 4在對血管性認知障礙的作用機制至今尚不完全明確,可能與下列因素有關:①引起血脂代謝紊亂,促進動脈粥樣硬化;②刺激巨噬細胞及泡沫細胞的形成,作用于脂蛋白的結構蛋白能直接參與動脈粥樣硬化的形成;③ε 4抗氧化能力弱于ε 3,ε 4對缺血性神經元損傷的保護性作用較差;ε 4基因攜帶者神經細胞缺血性損傷的程度較重;④ε 4可阻止神經細胞損傷后神經功能的恢復。

ApoEε 4等位基因對認知功能產生有害影響,因此,通過檢測ApoE基因型能夠早期發現發現VCI的高危人群,為早期干預VCI創造條件,從而減輕VCI對家庭和社會的危害。

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