黃芪多糖對兔動脈粥樣硬化內皮細胞功能的影響

曾國安,陳玉燕,李 博,吳清華

血管內皮細胞功能紊亂、內皮細胞損傷是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的顯著特點,急性冠脈綜合征及腦卒中患者體內均有不同程度的血管內皮細胞功能紊亂和損傷。在引起動脈粥樣硬化的眾多因素中,高膽固醇血癥、氧化應激反應過強、免疫調節功能異常是三個不可缺少的重要危險因素。AS是以動脈內皮細胞功能障礙、脂質沉積、炎癥反應、平滑肌細胞遷移與增殖為主的病理改變,是導致冠脈事件、腦卒中事件等心腦血管疾病的直接原因[1]。黃芪多糖(Astragaluspolysaccharids,APS)是從中藥黃芪中提取的有效活性成分,具有多種生物活性,以往的研究證實APS對心血管疾病有良好的預防作用,但其確切機制尚不完全清楚。本實驗依據APS抗氧化、免疫調節等作用[2],探討其對冠心病血管內皮功能及炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 新西蘭雄性兔40只,體重2.4 kg±0.3 kg,以普通飼料或高膽固醇飼料分籠喂養,室溫18℃～22℃,自由攝食、飲水。

1.2 試劑與藥品 三酰甘油(TG)測定試劑盒(GPO-PAP法)、總膽固醇(TC)測定試劑盒(CHOD-PAP法)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定試劑盒(磷鎢酸-鎂沉淀法):中生北控生物科技股份有限公司生產;丙二醛(M DA)測定試劑盒(硫代巴比妥酸法)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(黃嘌呤氧化酶法)、一氧化氮(NO)測定試劑盒(硝酸還原酶法):南京建成生物工程研究所生產;內皮素-1(ET-1)測定試劑盒(放射免疫法):北京東亞免疫技術研究所生產;C-反應蛋白(CRP)測定試劑盒(膠乳比濁法):上海捷門生物技術合作公司生產;卡托普利由上海華氏制藥有限公司生產;黃芪多糖由美國泛華醫藥公司北京代表處提供。

1.3 模型制備 隨機將40只新西蘭雄性兔分為4組,每組各10只?？瞻捉M:正常顆粒飼料;其余3組從實驗第1天起給予高脂飼料,牛血清1 mL/kg從耳緣靜脈注射1次;黃芪多糖(APS)組:普通飼料加質量分數為1.5%的膽固醇喂養,每天同時腹腔注射APS(500 mg/kg);卡托普利組:同時灌喂卡托普利(5 mg/kg),相當于臨床劑量的5倍;空白組、模型對照組給予等體積的生理鹽水4 mL/kg;實驗周期10周。測血清TG、TC、HDL-C、NO、MDA和CRP濃度以及SOD活性,并測血漿ET-1濃度,計算斑塊面積。并作形態學分析。

1.4 統計學處理 用SPSS 12.0軟件處理數據,計量資料以均數±標準差(±s)表示,采用t檢驗比較兩組均數間的差異。

2 結 果

2.1 各組新西蘭兔空腹 TG、TC、HDL-C、斑場面積比較(見表1) 模型對照組、APS組與空白組相比,空腹TG、TC均明顯升高(P＜0.05);APS組與模型對照組相比,TG明顯下降(P＜0.01),而 TC無明顯變化(P＞0.05),說明APS能降低 TG,但對TC無降低作用。模型對照組、APS組與空白組相比,HDL-C均因TC的升高而代償性地升高(P＜0.05),但模型對照組、卡托普利組的HDL-C/TC顯著低于空白組(P＜0.05),說明此時HDL-C不能充分運輸外周 TC回肝臟代謝,而 APS組的HDL-C/TC的比值與空白組較為接近(P＞0.05);模型對照組與卡托普利組各項指標無差異。APS組斑塊面積明顯低于模型對照組和卡托普利組(P＜0.01)。

表1 各組新西蘭兔空腹TG、TC、HDL-C比較(±s)

表1 各組新西蘭兔空腹TG、TC、HDL-C比較(±s)

組別 n TG(mmol/L) TC(mmol/L) HDL-C(mmol/L) HDL-C/TC(%) 斑塊面積(%)空白組 10 0.610±0.041 1.304±0.381 0.300±0.082 24.60±3.20 0模型對照組 10 4.056±0.3321) 34.501±1.2861) 4.349±0.7301) 12.50±1.74 62.10±5.701)卡托普利組 10 3.658±0.5281) 33.677±1.3741) 4.821±0.8101) 14.23±1.881) 58.03±2.301)APS組 10 0.774±0.0481)2) 34.228±1.2691) 7.081±0.6501)2) 20.57±1.302) 20.68±3.051)2)與空白組比較,1)P＜0.05;與模型對照組、卡托普利組比較,2)P＜0.01

2.2 各組新西蘭兔空腹血清MDA、NO、CRP、ET-1濃度及SOD活性(見表2) 模型對照組與空白組相比,空腹MDA、NO、CRP均明顯升高(P＜0.01);APS組與模型對照組相比,MDA、NO、CRP明顯下降(P＜0.05或 P＜0.01);同時,模型對照組SOD活性顯著下降(P＜0.01),但APS組SOD活性明顯高于模型對照組(P＜0.01)。模型對照組與空白組、APS組比較,ET-1濃度明顯升高;空白組與APS組比較,ET-1濃度無差異;模型對照組與卡托普利組各項指標無差異。

表2 各組新西蘭兔空腹血清MDA、NO、CRP、ET-1濃度及SOD活性比較(±s)

表2 各組新西蘭兔空腹血清MDA、NO、CRP、ET-1濃度及SOD活性比較(±s)

組別 n SOD(U/mL) MDA(nmol/mL) NO(μ mol/L) CRP(mg/L) ET-1(pg/mL)空白組 10 1.228±0.081 2.430±0.200 2.828±0.505 2.703±1.303 472.00±26.01模型對照組 10 0.915±0.0801) 49.821±11.5031) 8.655±1.0611) 9.244±3.3511) 511.16±21.541)卡托普利組 10 0.954±0.0711) 36.150±17.1041) 7.617±1.2491) 6.451±2.7031) 505.23±25.091)APS組 10 1.167±0.0792) 4.851±0.7381)2) 5.729±0.4911)2) 4.705±2.2341)3) 478.21±28.983)與空白組比較,1)P＜0.01;與模型對照組、卡托普利組比較,2)P＜0.01;與模型對照組比較,3)P＜0.05

2.3 主動脈AS病理學觀察 對照組家兔主動脈內膜光滑,未見斑塊形成。蘇丹IV染色后,模型對照組、卡托普利、APS組主動脈內膜均有肉眼可以觀察到的不同程度的紅色斑塊,呈點、斑、條狀,有些融合成片,邊界清晰,突出于內膜表面,但表面無明顯破潰,病變以主動脈弓處最為嚴重。光學顯微鏡下,正常主動脈壁內皮完整無損傷;模型對照組血管內粥樣硬化斑塊明顯向內膜凸起,纖維帽下可見大量泡沫細胞和少量細胞碎片,斑塊處中膜平滑肌細胞受壓萎縮,可見平滑肌細胞增生;卡托普利組與模型對照組類似;APS組與模型對照組比較病變明顯減輕,出現少量的泡沫細胞。

3 討 論

AS的發病過程十分復雜,血漿中ET-1升高是AS快速進展的危險標志[3]。本組實驗結果顯示,高脂飼料喂養新西蘭兔10周,血清 TG、TC、ET-1明顯升高,HDL-C/TC 明顯降低,說明HDL對膽固醇的清除能力降低,可引發類似人類AS的病變。病理學觀察,主動脈均形成明顯的脂質斑塊和粥樣斑塊,證明了高脂血癥及 AS模型成功,APS組 TG、ET-1明顯降低,HDL-C/TC明顯升高,提示APS可干預AS的形成和發展。卡托普利為血管緊張素轉換酶抑制劑,可通過減少血管緊張素Ⅱ的生成和緩激肽的降解,增加NO的合成,保護血管內皮細胞,已廣泛應用于高血壓和心力衰竭的治療。高劑量卡托普利能防止高脂喂養的動物形成明顯的AS[4],而本組實驗使用15.0 mg/(kg?d),是人用劑量的6倍,結果顯示對AS的形成無防治作用,進一步證實卡托普利對AS形成的抑制作用與劑量有關。大量研究表明,脂質過氧化是AS發生的重要環節,高脂血癥時,體內自由基的產生和清除之間的平衡遭到破壞[5],許多自由基清除劑如SOD活性降低,產生大量脂質過氧化物(LPO)及其終產物MDA,LPO可直接損傷內皮細胞,導致內皮細胞退行性變化和通透性增強,氧化修飾的低密度脂蛋白(ox-LDL)可促進單核細胞和平滑肌細胞對 LDL的吞噬,減少膽固醇的清除,加速泡沫細胞的形成[6,7]。Bjorkerucl等的研究證明,ox-LDL能誘導血管平滑肌細胞(vascular smoooeh musclecells,VSMC)凋亡、增殖與凋亡失衡,與AS及其并發癥的形成有關。本實驗觀察到,APS能明顯降低血清LPO,升高SOD活性,增強抗氧化能力,以及保護內皮細胞的功能,從AS形態學進一步證實,APS能明顯減輕或減少粥樣斑塊的程度和面積,HE染色后光鏡觀察,內膜下泡沫細胞層數減少,平滑肌細胞增生減輕。炎癥學說與細胞凋亡是AS研究的新領域,相關文獻報道,AS病變中不僅含有大量的脂質,而且有大量炎癥細胞浸潤,且在AS發展的不同時期均有慢性炎癥反應。有人發現急性冠脈綜合征患者的外周血中含有炎性介質,如白介素-6(IL-6)、CRP,以及促炎性細胞因子白介素-1 β(L-1 β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)等濃度明顯升高,同時,ox-LDL能刺激T細胞,激活炎癥反應,誘導巨噬細胞和血管壁細胞多種炎癥介質的表達,這些因子將AS灶內各種細胞間通過自分泌、旁分泌相互聯系、相互影響,使病變得以發展[1],而炎癥過程最具有標志的因子是 CRP[8]。本組實驗結果顯示,AS模型組中 NO、CRP濃度升高,APS組NO、CRP濃度明顯降低。NO是血管內皮舒張因子,具有擴張血管、抗血小板黏附聚集、抑制VSMC增殖等保護血管的作用,是生理狀態下對抗AS發生發展的重要因素。本組實驗中的AS模型為粥樣斑塊期,可見淋巴細胞和單核細胞浸潤,提示炎癥反應的存在,在炎性介質和細胞因子IL-1β、TNF-α等刺激下,誘導血管平滑肌細胞、巨噬細胞等誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達,產生大量NO,NO又與反應產生ONOO-,后者釋放NO2、?OH,加重內皮細胞的損傷,誘導內皮細胞凋亡,促使AS發展[9,10],最近發現在正常血管和AS各階段的VSMC中都存在細胞凋亡,尤其在晚期則有大量細胞凋亡[11]。同時,ox-LDL、TNF-α等也能誘導細胞凋亡。總之,黃芪多糖可明顯降低血清中總膽固醇、三酰甘油、丙二醛和內皮縮血管肽的含量,從而減輕內皮縮血管肽對血管的損傷作用;同時升高一氧化氮、超氧化物歧化酶及總抗氧化活力。應用黃芪多糖家兔光鏡下可見腹主動脈內膜表面基本光滑,內皮細胞形態基本完好,提示其具有較好的對抗氧化損傷和保護血管內皮細胞的功能。本組實驗結果支持上述觀點,APS具有免疫調節作用,抑制促炎性細胞因子的產生和釋放,具有抗AS的作用,但詳細機制有待進一步證實[12]。

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