燈盞花素聯(lián)用三七總苷對(duì)急性腦梗死大鼠ICAM-1的影響

郭志成,李 麗

急性腦缺血,又名腦卒中,是以急性起病,神經(jīng)功能缺損至少持續(xù)24 h為特征的綜合征,系因腦循環(huán)障礙導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部受累。三七總苷是采用中藥三七的主要藥用成分制成的中藥注射液,具有改善微循環(huán)、抑制血小板聚集作用[1]。并對(duì)缺血再灌注損傷腦組織具有保護(hù)作用[2]。燈盞花素注射液是燈盞細(xì)辛提取物。現(xiàn)已鑒定燈盞細(xì)辛的主要化學(xué)成分有黃酮、吡喃酮、倍半萜和咖啡酸酯等10余種化合物[3]。多項(xiàng)研究表明燈盞細(xì)辛能減輕缺血再灌注腦損傷程度,具有顯著的腦保護(hù)作用[4]。在臨床對(duì)單味藥的研究,運(yùn)用較多,不僅用于腦血管系統(tǒng),也已運(yùn)用于其他系統(tǒng),但對(duì)二藥聯(lián)用治療急性腦梗死,其實(shí)驗(yàn)、臨床報(bào)道甚少。本研究運(yùn)用二藥辛、苦、溫結(jié)合,觀察使用后對(duì)細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)的影響,探討二藥有機(jī)結(jié)合后其更強(qiáng)的袪除痰瘀阻絡(luò)病理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 三七總苷粉劑(絡(luò)泰):昆明制藥集團(tuán)股份有限公司,批號(hào)Z20026438;燈盞花素粉劑:衡陽(yáng)恒生制藥有限公司,批號(hào):2002ZFB0390;ICAM試劑盒,購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動(dòng)物 Waster大鼠,體重220 g～280 g,由山西醫(yī)科大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 分組及給藥 將50只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組10只和實(shí)驗(yàn)組40只,另將40只大鼠造模成功后隨機(jī)分為模型組、燈盞花素組、三七總苷組和中藥聯(lián)用組,每組10只。假手術(shù)組:完成全部操作,只做頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分離。模型組:造模成功后,術(shù)后2 h開(kāi)始腹腔注射生理鹽水 1 mL,一日1次,連用 3 d。燈盞花素組:16 mg/kg,稀釋至1 mL,腹腔注射,每日1次,連用 3 d。三七總苷組:80 mg/kg,稀釋至 1 mL,腹腔注射,每日1次,連用3 d。中藥聯(lián)用組:將上述燈盞花素和三七總苷劑量各半,共1 mL,分別腹腔注射,每日1次,連用3 d。

1.4 模型制作 大腦中動(dòng)脈線栓法模型制備:參照Z(yǔ)ea Longa[5]的方法,稍加改進(jìn)。大鼠以10%的水合氯醛0.35 mL/100 g腹腔注射,仰臥固定,頸正中切口,依次暴露右側(cè)頸總,頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈,結(jié)扎頸總動(dòng)脈,頸外動(dòng)脈,于頸總動(dòng)脈分叉下方煎一切口,將預(yù)先用酒精燈燒成圓頭的尼龍漁線(長(zhǎng)4 cm,直徑0.2 mm)置于頸內(nèi)動(dòng)脈18 mm到有輕微阻力感為止,扎緊動(dòng)脈線端,縫合皮膚。假手術(shù)組大鼠麻醉后,僅暴露頸內(nèi)外動(dòng)脈分支并分離,不閉塞大腦中動(dòng)脈。術(shù)中、術(shù)后室溫控制24℃～25℃,大鼠體溫維持在36.5℃～37.5℃。麻醉清醒(約術(shù)后2 h)對(duì)大鼠神經(jīng)缺損進(jìn)行評(píng)分,如評(píng)分在2分或2分以上者則認(rèn)為模型成功并納入實(shí)驗(yàn)。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1 大鼠神經(jīng)缺損評(píng)分 參照Bederson 10分法[6]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分:①提起鼠尾,觀察前肢有無(wú)異常表現(xiàn)。凡有前肢內(nèi)收,內(nèi)旋者,視其輕重評(píng)分(1分～3分),如果軀體向左側(cè)旋轉(zhuǎn),評(píng)為4分。②將大鼠置于金屬網(wǎng)上,向后輕提鼠尾,觀察大鼠兩前肢張力,根據(jù)左前肢張力下降程度,評(píng)為0分～2分。③將大鼠置于光滑平面上觀察側(cè)向推動(dòng)阻力,根據(jù)向左側(cè)推擋阻力下降程度評(píng)分(0分～2分)。④大鼠出現(xiàn)左眼上瞼下垂,左眼分泌物增多評(píng)為2分。動(dòng)脈缺血72 h再評(píng)分,其結(jié)果作為評(píng)價(jià)療效的指標(biāo)之一。

1.5.2 血清中ICAM-1含量測(cè)定 每組于 6 h、24 h、72 h各時(shí)間點(diǎn)頸靜脈取血,取血清低溫保存用ELISA法測(cè)定值,方法詳見(jiàn)ICAM-1試劑盒。

1.5.3 腦梗死體積測(cè)定 大鼠腦梗死面積百分比計(jì)算:末次評(píng)分采血完畢后,每組隨機(jī)取5只大鼠斷頭取腦,去除小腦后,將大腦平均冠狀切片分 5片,放于TTC溶液中,37℃溫育10 min～15min,腦組織切片梗死區(qū)不著色,正常腦組織染成紅色,用生理鹽水沖洗后攝影,在照片上用透明坐標(biāo)紙測(cè)量梗死截面積和全腦截面積,根據(jù)切片厚度計(jì)算出總的梗死灶與對(duì)側(cè)總體積百分比。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清值 ICAM-1含量比較(見(jiàn)表1) 模型組ICAM-1值隨腦梗死時(shí)間延長(zhǎng),相應(yīng)值漸升高,中藥各組隨時(shí)間延長(zhǎng),ICAM-1值逐漸下降。與模型組比,中藥各組 ICAM-1值下降(P＜0.05),中藥聯(lián)用組比單用中藥組下降更明顯(P＜0.05)。

表1 各組大鼠血清值 ICAM-1含量比較(±s) ng/mL

表1 各組大鼠血清值 ICAM-1含量比較(±s) ng/mL

組別 n 6 h 24 h 72 h假手術(shù)組 10 14.94±0.67 15.69±0.61 17.10±0.74模型組 10 36.55±0.791) 38.92±0.541) 43.89±0.821)燈盞花素組 10 11.99±0.422) 10.72±0.682) 8.98±0.492)三七總苷組 10 11.56±0.292) 9.23±0.412) 8.16±0.532)中藥聯(lián)用組 10 8.57±0.472)3) 6.78±0.352)3) 6.30±0.372)3)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.05;與模型組比較,2)P＜0.05;與燈盞花素組和三七總苷組比較,3)P＜0.05

2.2 各組大腦中動(dòng)脈栓塞神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較(見(jiàn)表2)

表2 各組大腦中動(dòng)脈栓塞神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較(±s) 分

表2 各組大腦中動(dòng)脈栓塞神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較(±s) 分

組別 n 神經(jīng)功能缺損評(píng)分模型組 10 7.56±0.70燈盞花素組 10 5.48±0.631)三七總苷組 10 5.46±0.601)中藥聯(lián)用組 10 4.70±0.491)2)與模型組比較,1)P＜0.05;與燈盞花素組和三七總苷組比較,2)P＜0.05

2.3 各組大鼠腦梗死面積的測(cè)定比較(見(jiàn)表3)

表3 各組大鼠腦梗死體積的影響(±s) %

表3 各組大鼠腦梗死體積的影響(±s) %

組別 n 腦梗死體積模型組 5 20.230±6.170燈盞花素組 5 12.236±9.3651)三七總苷組 5 11.249±10.1491)中藥聯(lián)用組 5 10.314±9.3061)2)與模型組比較,1)P＜0.05;與燈盞花素組和三七總苷組比較,2)P＜0.05

3 討 論

急性腦梗死系因腦循環(huán)部分或一側(cè)循環(huán)障礙導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部受累。在絕大多數(shù)病例中,頸部和腦底部大的顱外動(dòng)脈的粥樣硬化是腦梗死的基本病因。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)制尚未完全明了,但內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及所引起的功能障礙被認(rèn)為是早期階段[7],腦缺血損傷后機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的病理、生理過(guò)程,腦血流中斷造成局部腦組織的缺血、缺氧,造成腦組織的能量障礙,同時(shí)又存在著血流對(duì)腦組織的再灌注,這些會(huì)使腦組織細(xì)胞產(chǎn)生損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在此級(jí)聯(lián)反應(yīng)中有許多不同的機(jī)制,其中局部炎癥因子,趨化因子和黏附分子等表達(dá)上調(diào)構(gòu)成了缺血損傷的基礎(chǔ),起始因素雖是炎癥因子,但黏附分子在炎癥因子、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板及損傷區(qū)均起到了關(guān)鍵作用。ICAM-1又稱CD54,屬于免疫球蛋白超家族中的一員,它介導(dǎo)白細(xì)胞、血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附、聚集、促使血栓形成,加重壞死區(qū)炎性反應(yīng),使病情惡化。在白介素(IL-1)、腫瘤壞死因子等刺激下表達(dá)急劇增加,與腦梗死發(fā)生的病程密切相關(guān),它的濃度不僅反應(yīng)白細(xì)胞參與損傷的程度,而且與梗死面積明顯相關(guān),而與病變部位無(wú)明顯關(guān)系[8]。原因是梗死面積越大,受累血管的數(shù)量越多,微血管內(nèi)皮細(xì)胞受到刺激表達(dá)的ICAM-1越多,因此,動(dòng)態(tài)觀察血清ICAM-1的水平有助于利斷腦梗死的發(fā)展趨勢(shì)。故ICAM-1在腦梗死急性期炎性反應(yīng)中起重要作用。本研究觀察到隨著大鼠腦梗死的病情發(fā)展,ICAM-1濃度增高,隨著用藥改善腦供血,ICAM-1濃度逐漸降低。

急性腦梗死屬于中醫(yī)“中風(fēng)”范疇,其病因主要是積損正虛,氣血虧虛,復(fù)因情志、飲食、勞逸失度,使臟腑功能失調(diào),氣血升降異常,痰濕內(nèi)生,肝風(fēng)內(nèi)動(dòng),挾痰挾火,橫竄經(jīng)絡(luò),上蒙清竅致中風(fēng)發(fā)生,因起病突然,變化多端,癥狀多變,類似中醫(yī)病因中的“風(fēng)邪”特點(diǎn),加之急性期以痰瘀阻絡(luò)為主。本著“急則治標(biāo)”的原則,為盡早恢復(fù)缺血腦組織的血供,故筆者提出以辛溫祛風(fēng)化痰通絡(luò)藥物為主,起到疏通經(jīng)絡(luò),祛除痰瘀,使氣血復(fù)健。因祛風(fēng)藥物具有辛、散、溫、通、竄、透等多種特性,能發(fā)揮開(kāi)郁暢氣,發(fā)散祛邪,燥濕化痰,通絡(luò)開(kāi)竅,化瘀通絡(luò)等作用[9]。燈盞細(xì)辛是菊科短葶飛蓬的干燥全草,盛產(chǎn)于云南。據(jù)《本草綱目》記載:燈盞花性辛,微溫,具有散寒解表、活血舒筋、祛風(fēng)除濕等功效,用于心痛,風(fēng)濕痹痛,癱瘓等。其有效成分是黃酮類物質(zhì),具有擴(kuò)血管,改善微循環(huán),增加組織灌注,改善血液流變性及改善脂質(zhì)代謝等作用,另有消除氧自由基,對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化,抑制炎癥介質(zhì)的形成和釋放,防治神經(jīng)元的缺血性損傷。三七總苷是三七的主要提取物,三七為五加科人參屬植物,是中醫(yī)治療各種血癥和血瘀的“圣藥”。李時(shí)珍《本草綱目》記載:三七能治一切血癥。味甘、性溫、微苦,歸肝胃經(jīng),具有絡(luò)血化瘀,止血定痛等功效。現(xiàn)代研究證明:三七含有24種三七皂苷和其他生物活性物質(zhì),在血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)及抗炎、抗衰老等方面均顯示了強(qiáng)大的生理活性,被譽(yù)為“適應(yīng)原樣藥物”。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明三七注射液對(duì)大鼠急性缺血缺氧后的腦細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用[10]。本實(shí)驗(yàn)將燈盞花素和三七總苷聯(lián)合應(yīng)用,以燈盞花素偏于祛風(fēng)化痰祛濕,以散風(fēng)為主,三七總苷偏于活血化瘀,以“破透”血絡(luò)為主,二者結(jié)合將散風(fēng)與祛除痰瘀病理產(chǎn)物結(jié)合起來(lái),相互為用,祛風(fēng)有助于祛濕化痰,行血,而活血化瘀又有助于風(fēng)藥暢行無(wú)阻,從而得以祛除全身之痰濕,恢復(fù)失常之氣血循行。“巔頂之上唯風(fēng)可到”,故風(fēng)藥又可起到引藥入病所,使陽(yáng)氣上升,濁陰下降,清氣上充腦竅,更加有利于缺血腦細(xì)胞功能的恢復(fù)。故風(fēng)藥與活血化瘀藥結(jié)合比單純使用活血化瘀藥治療腦梗死療效要佳。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果亦證實(shí)了這一點(diǎn)。其作用機(jī)制可能與風(fēng)藥能有效抑制細(xì)胞黏附分子表達(dá)的上調(diào),從而減少炎癥因子的釋放及炎癥因子、血小板與受損內(nèi)皮間的黏附、聚集,改善微血管閉塞,減輕缺血缺氧有關(guān)。發(fā)揮中藥有機(jī)結(jié)合后多途徑、多靶點(diǎn)作用。

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