細(xì)胞代數(shù)與5-氮胞苷濃度對(duì)體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞定向分化的影響1)

王 寧,李新華,邢萬(wàn)紅,陳 平

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一群中胚層來(lái)源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞[1],它廣泛存在于成體器官和結(jié)締組織中[2],最早發(fā)現(xiàn)于骨髓[3]。骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞是一種比較原始的骨髓基質(zhì)細(xì)胞,被稱為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/祖細(xì)胞(bone marrow-mesenchymal stem cells,BM-MSCs),也被稱為骨髓來(lái)源的多潛能基質(zhì)細(xì)胞[4]。自從Wakitani等報(bào)道MSCs可以分化為心肌細(xì)胞,M angi等[5]報(bào)道MSCs可以修復(fù)損傷的心臟以來(lái),MSCs成為心臟修復(fù)和心肌組織工程種子細(xì)胞最熱門的候選來(lái)源。但其骨髓中的含量很低,僅占骨髓中單個(gè)核細(xì)胞的1/106～1/105。細(xì)胞在擴(kuò)增過(guò)程中保持多潛能性,但該能力會(huì)隨著過(guò)度擴(kuò)增和不恰當(dāng)操作而減弱[4],因此本實(shí)驗(yàn)探討大鼠MSCs細(xì)胞代數(shù)對(duì)增值與誘導(dǎo)分化能力的影響,及在能獲得充足細(xì)胞數(shù)量的同時(shí),又不減弱細(xì)胞多潛能性的最佳時(shí)期。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 清潔級(jí)雄性SD大鼠,4周齡,體重100 g～120 g,由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。胎牛血清(美國(guó)HyClone公司);5-氮胞苷(5-Azα,美國(guó) Sigma公司);噻唑蘭(M TT,美國(guó)Sigma公司);一抗:兔抗鼠cT nT抗體(上海藍(lán)基生物科技有限公司),兔抗鼠α-action抗體(上海藍(lán)基生物科技有限公司);過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素染色試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司)。

1.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng) CO2窒息處死動(dòng)物,無(wú)菌條件下取大鼠股骨和脛骨,以完全培養(yǎng)液沖洗骨髓腔。按照1:1的比例將上述細(xì)胞懸液緩慢滴加到密度為1.077 g/mL的Percoll分離液上層,1 500 r/min離心30 min。吸取上、中層液面間的乳白色云霧狀的單個(gè)核細(xì)胞層,加入完全培養(yǎng)液重懸,離心洗滌2次。加入培養(yǎng)液以2×105/cm2～3×105/cm2

細(xì)胞密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶,置于37℃,5%CO2,飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng) 72 h換液,達(dá)60%～70%融合狀態(tài),傳代培養(yǎng)。

1.3 各代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖率測(cè)定及體外誘導(dǎo) 取第2代MSCs,消化后調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至3×104/mL,接種于7個(gè)96孔板,每孔加入200 L,設(shè)調(diào)零孔5個(gè)。5%CO2,37℃孵育4 h待細(xì)胞貼壁。于貼壁后每天各取一板,每孔加入20 μ L M TT溶液(5 mg/mL,即 0.5%M TT),37℃繼續(xù)孵育4 h后吸取孔內(nèi)上清液棄去。每孔加入150μ L二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,使紫色結(jié)晶充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光值(OD值),記錄結(jié)果。選取第2代、第 6代、第10代 MSCs以3×104/mL細(xì)胞密度分別接種于96孔板,每代種植3板,貼壁12 h。每板分為4組,每組23孔,余4孔為調(diào)零孔。每板取3組為誘導(dǎo)組,分別以含 5μ mol/L、10μ mol/L 、15μ mol/L 5-氮胞苷的完全培液孵育24h,對(duì)照組每板23孔以完全培液孵育24 h,后改用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)5 d。采用 MTT法,測(cè)取誘導(dǎo)后各代細(xì)胞第 1天、第3天、第5天的OD值。同時(shí)取第2代、第 6代、第10代細(xì)胞,以含5 μ mol/L、10μ mol/L、15 μ mol/L 5-氮胞苷的完全培養(yǎng)液誘導(dǎo) 24 h后,培養(yǎng)4周,并設(shè)未誘導(dǎo)組為陰性對(duì)照。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化和生長(zhǎng)情況。

1.5 心肌特異性蛋白cTnT、α-Actin的檢測(cè) 將誘導(dǎo)培養(yǎng)4周的第2代、第6代、第10代細(xì)胞玻片,PBS清洗后4%多聚甲醛室溫固定 30 min。蒸餾水沖洗 3次,每次3 min。3%H2O2去離子水孵育5 min～10 min。滴加山羊血清室溫孵育10 min,傾去勿洗。滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗,4℃過(guò)夜。PBS清洗,3 min×3次;滴加生物素化二抗工作液(IgG/Bio),37℃孵育10 min。PBS清洗,3 min×3次;滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,37℃孵育10 min。PBS清洗,3 min×3次;DAB顯色。沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對(duì)樣本資料進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用方差分析,組間兩兩比較進(jìn)行SNK法檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察 通過(guò)密度梯度離心法獲得的MSCs,接種于完全培養(yǎng)基中,48 h呈現(xiàn)為短紡錘、三角形短小細(xì)胞,細(xì)胞折光性好,可見(jiàn)黏附于細(xì)胞表面的Percoll顆粒。72 h成為細(xì)長(zhǎng)紡錘、細(xì)長(zhǎng)梭形細(xì)胞。第4天,細(xì)胞開(kāi)始增殖,伴有較多的折光雙聯(lián)體,并形成小島狀克隆,細(xì)胞密度較低時(shí),細(xì)胞排列不規(guī)則,可見(jiàn)三角形細(xì)胞。7 d～10 d可達(dá)70%～80%融合狀,細(xì)胞排列開(kāi)始規(guī)整,呈束狀、旋渦狀或魚(yú)群狀。細(xì)胞傳至第2代,細(xì)胞形態(tài)趨于一致,細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣。傳至第6代,可見(jiàn)少量圓形扁平細(xì)胞,約占細(xì)胞總數(shù)的5%,并隨細(xì)胞傳代次數(shù)的增加,有所增加但不明顯。此類細(xì)胞的增殖和克隆能力明顯低于紡錘樣成纖維樣細(xì)胞。

2.2 MSCs的體外誘導(dǎo)分化 各代細(xì)胞經(jīng) 5μ mol/L、10 μ mol/L、1 5μ mol/L5-Azα誘導(dǎo)液分別誘導(dǎo)24h,細(xì)胞均有死亡,且隨藥物濃度的升高細(xì)胞死亡率升高,但細(xì)胞代數(shù)對(duì)細(xì)胞的死亡率影響不明顯。細(xì)胞誘導(dǎo)24 h,貼壁的部分細(xì)胞變扁平或呈短棒狀。3 d后存活細(xì)胞開(kāi)始增殖,細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)梭形,少數(shù)細(xì)胞呈三角形或多邊形。培養(yǎng)4周后,80%～90%細(xì)胞呈肌纖維狀,少數(shù)細(xì)胞為三角、多邊形或鋪路石狀,細(xì)胞出現(xiàn)聚集狀生長(zhǎng)。不同代數(shù)細(xì)胞經(jīng)不同濃度5-氮胞苷誘導(dǎo)四周后均未見(jiàn)自發(fā)性搏動(dòng)。

2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及增殖率測(cè)定 MSCs傳代培養(yǎng)潛伏期約1 d～2 d,第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)增殖期,第6天～第7天進(jìn)入平臺(tái)期。不同濃度5-氮胞苷誘導(dǎo)的各代MSCs,通過(guò)MT T檢測(cè),顯示誘導(dǎo)后的第2代MSCs增殖能力優(yōu)于第6代和第10代細(xì)胞,第6代與第10代MSCs增殖能力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。未經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)的對(duì)照組顯示,第2代與第6代細(xì)胞增殖能力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,均優(yōu)于第10代細(xì)胞。藥物對(duì)細(xì)胞增殖能力有一定影響,但隨細(xì)胞代數(shù)的增加其影響有減弱的趨勢(shì);藥物濃度對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表1。

表1 相同濃度5-Aza誘導(dǎo)后第2代、第6代、第10代MSCs及對(duì)照組第5天增值率(±s)

表1 相同濃度5-Aza誘導(dǎo)后第2代、第6代、第10代MSCs及對(duì)照組第5天增值率(±s)

細(xì)胞代數(shù) 對(duì)照組 5 μ mol/L 10 μ mol/L 15 μ mol/L第2代 0.44±0.23 0.53±0.28 0.77±0.283)4) 0.89±0.283)4)第6代 0.42±0.25 0.03±0.201) 0.06±0.131)3) 0.04±0.201)3)第10代 0.26±0.191)2) 0.15±0.241) 0.19±0.201) 0.13±0.181)與第2代比較,1)P＜0.05;與第6代比較,2)P＜0.05;與對(duì)照組比較,3)P＜0.05;與5 μ mol/L比較,4)P＜0.05

2.4 心肌特異性肌鈣蛋白cTnT的檢測(cè) 以三種不同濃度5-Aza體外誘導(dǎo)四周的第2代、第6代、第10代BM-MSCs進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè) cTnT、α-Actin表達(dá),各誘導(dǎo)組均表達(dá)陽(yáng)性。說(shuō)明經(jīng)三種濃度5-Aza誘導(dǎo)后的第2代、第6代、第10代BM-MSCs已向心肌定向誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化,并表達(dá)心肌特異性蛋白。

3 討 論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種比較原始的骨髓基質(zhì)細(xì)胞,因其具有自我更新、擴(kuò)增和多向分化潛能,在適宜條件下可被誘導(dǎo)分化為多種組織細(xì)胞[6],能夠分泌多種細(xì)胞因子,支持組織再生和修復(fù),獲取途徑便利,易體外培養(yǎng)擴(kuò)增,回植無(wú)免疫排斥反應(yīng),對(duì)組織損傷小等優(yōu)點(diǎn)[1,4],使得科學(xué)家們開(kāi)始廣泛關(guān)注MSCs在組織修復(fù)和基因治療中的臨床應(yīng)用。因其具有心肌和血管修復(fù)潛能的優(yōu)點(diǎn)[2],已成為心肌組織工程研究中種子細(xì)胞來(lái)源的熱點(diǎn)之一。但MSCs在骨髓中的含量很低,細(xì)胞培養(yǎng)接近高密度時(shí),細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期,由紡錘體樣形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檩^大較平的表型[7],細(xì)胞的增殖與分化能力可能受到影響。在治療心肌損傷的疾病時(shí),無(wú)論是采用經(jīng)外周靜脈、冠脈、心內(nèi)膜及心外膜注射等途徑,還是進(jìn)行心肌組織工程構(gòu)建,首先需要有足夠的細(xì)胞數(shù)量和良好的細(xì)胞分化能力,因此如何獲得充足細(xì)胞數(shù)量,同時(shí)保持細(xì)胞良好的增殖分化能力,成為合理應(yīng)用MSCs的前提。

能否實(shí)現(xiàn)MSCs在體外既保持良好的增殖分化能力又保持多潛能分化能力?李克等[8]將攜帶人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)目的基因的質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入人骨髓MSCs中,顯示外源性hTERT基因可以在人骨髓 MSCs中獲得異位表達(dá),并能誘導(dǎo)人骨髓MSCs的端粒酶活性,使人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的壽命明顯延長(zhǎng)而且不影響其維持干細(xì)胞的多向分化潛能特性。徐燕等[9]通過(guò)攜帶人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶目的基因的反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人骨髓MSCs,達(dá)到了相似的效果。張海紅等[10]通過(guò)促紅細(xì)胞生成素與 MSCs共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)MSCs的增殖指數(shù)明顯增加,促紅細(xì)胞生成素呈時(shí)間、劑量依賴性促進(jìn)MSCs增殖。亦有通過(guò)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子,中藥提取物等促進(jìn)MSCs增殖的報(bào)道。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞傳代次數(shù)對(duì)細(xì)胞數(shù)量、增殖能力、分化能力和純度均有影響。相同藥物濃度誘導(dǎo)后的第2代細(xì)胞增殖能力優(yōu)第6代、第10代細(xì)胞,第6代、第 10代細(xì)胞增殖率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同藥物濃度誘導(dǎo)的同代細(xì)胞間增殖能力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著細(xì)胞代數(shù)的增加,藥物濃度對(duì)細(xì)胞的增殖能力影響越來(lái)越小。經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)的BMSCs表達(dá)心肌特異蛋白cTnT、α-Actin,未經(jīng)誘導(dǎo)的BMSCs不表達(dá)心肌特異蛋白。錢海燕等[11]研究表明,第 10代MSCs經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)后心肌特異性蛋白的表達(dá)率明顯高于第1代、第4代、第8代細(xì)胞。由此推之,在增殖能力相同的情況下,細(xì)胞代數(shù)越高,越有利于細(xì)胞數(shù)量和誘導(dǎo)分化能力的提高,越有利于細(xì)胞移植、組織構(gòu)建、臨床應(yīng)用中對(duì)細(xì)胞數(shù)量和時(shí)間的要求。但細(xì)胞增殖能力的強(qiáng)弱與誘導(dǎo)率的高低是否存在一定關(guān)系,增殖能力與誘導(dǎo)率何者更有利于修復(fù)壞死的心肌還有待進(jìn)一步研究。

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