頸交感神經干離斷對CCl4所致大鼠肝損傷肝功能的影響

曾 議,夏 鋒,田 峰,程 龍,王曙光

(第三軍醫大學附屬西南醫院全軍肝膽外科研究所、西南肝膽外科醫院,重慶,400038)

當前研究表明化學性去肝內交感神經可以減輕CCl4所致肝損害程度,有利于肝臟合成功能改善和膽紅素的代謝[1]。但對于交感神經系統如何調控肝臟功能的途徑尚不明確。交感神經系統由中樞和外周兩大部分組成,其中樞結構包括初級中樞和高級植物性中樞,以及中樞間的聯系;外周結構是由神經節和聯合神經節的神經纖維組成,其分布、走形較為彌散,構成復雜的網絡。肝臟交感神經調控系統由腹腔神經節、脊髓胸腰段、下丘腦交感中樞三個不同層次的中樞構成[2]。本實驗應用頸交感神經離斷大鼠模型[3],探討在交感神經調控系統高級中樞節段去交感神經狀態下,對急性肝損傷時肝功能的影響,以了解肝臟的交感神經調控機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

全自動生化分析儀、CCl4(重慶化學試劑公司),RM6280C多通道生理信號采集儀(成都儀器廠),CoulArray高效液像色譜-電化學檢測系統5600A CA-1001(USA),雙人雙目手術顯微鏡。

1.2 實驗動物與分組

健康雄性Wistar大鼠共30只,體質量190～220 g,均由第三軍醫大學實驗動物中心提供。隨機分成3組,每組10只。

1.2.1 A組(正常對照組):大鼠經0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,僅以腹腔注射相同劑量滅菌生理鹽水(0.2 mL/100 g):B假手術組(Sham組)大鼠以0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。麻醉成功后,脫毛劑脫去頸部切口毛發,皮膚消毒取頸正中切口剪開皮膚、手術顯微鏡下分離氣管旁右側,暴露右頸總動脈及神經節,于右側頸總動脈分叉處的背側面找到頸上神經節,距其下3 mm尋找右側頸交感神經干?？梢娨恍毕蛲庀伦咝慰邕^頸總動脈前方的神經纖維,以微量注射器針頭小心挑起、分離右頸交感神經干,分離一段節后纖維,置于0.4 mm直徑鉑金絲正負電極上,懸空記錄神經沖動發放電位,陰極電極夾于切緣皮膚。手術野滴注溫熱的液體石蠟油以防神經干燥,觀察神經纖維放電的情況,如放電的幅度、波形等并打印記錄。待交感神經放電趨于穩定后,腹腔注射10%CCl4石蠟油液[4](0.2 mL/100 g,由CCl4原液和滅菌石蠟油按體積比1∶9配制而成);并持續記錄交感神經干神經沖動電位發放變化約10 min C頸交感干離斷組:大鼠在行前操作的基礎上,切斷右交感神經干[5],腹腔注射10%CCl4溶液;手術完畢后縫合切口。手術組動物在麻醉清醒后,若出現同側眼裂變窄、瞳孔縮小等典型的霍納綜合征(Horner′s syndrome)則證明頸交感干離斷。

1.2.2 B、C組分別于實驗后第4、7、10天經腹腔注射追加相同劑量10%CCl41次,A組注射相同劑量的生理鹽水,第10天注射完CCl4液24 h后。采取同一時段放血處死大鼠。處死前由下腔靜脈抽血,3 900 r/min離心10 min后取血清-20℃冰箱保存,檢測肝功能;處死后取同一部位肝組織,以冰生理鹽水沖洗干凈血跡后切取小塊肝組織,濾紙吸去多余水份,以CoulArray高效液像色譜-電化學法測定肝組織內NE濃度;另取小塊肝組織,以 10%甲醛固定后行病理切片染色。

1.3 檢測指標與方法

全自動生化分析儀檢測各組肝功能各項指標,前白蛋白(PA):免疫比濁法;白蛋白(Alb):溴甲酚氯比色法;總膽紅素(TB)和直接膽紅素(BD):速率法。ALT、AST操作方法參見試劑盒說明書。

頸交感神經神經沖動發放的電生理記錄按參考文獻[6]方法加以改進。

Coularray高效液相色譜-電化學法測定肝組織內NE濃度。

肝組織石蠟切片HE染色按照石蠟切片HE染色常規造作進行。

2 結 果

2.1 頸交感神經干離斷狀態對肝臟功能各項指標的影響

結果顯示:shame組和手術組相比較白蛋白和前白蛋白,結果有顯著差異(P<0.05);AST、ALT有顯著差異(P<0.05)。shame組與手術組總膽紅素比較具有顯著差異(P<0.05)。結果表明,同shame組相比較,頸交感干離斷有利于CCl4所致肝損害后蛋白合成功能的改善、膽紅素的代謝和降低AST、ALT。

表1 各組大鼠血清肝功能指標( ±s)

表1 各組大鼠血清肝功能指標( ±s)

與假手術組比較,＊P<0.05

組別 正常對照組 假手術組 頸交感干離斷組ALT(IU/L)51±2 158±13 84±8＊AST(IU/L)47±4 225±5 144±16＊白蛋白(g/L)36.0±1.231.7±0.34 35.9±0.30＊前白蛋白(g/L)0.15±0.030.07±0.01 0.16±0.01＊總膽紅素(μ mol/L)0.7±0.13 2.1±0.18 1.3±0.3＊直接膽紅素(μ mol/L)0.5±0.12 1.8±0.2 1.0±0.2＊

2.2 頸交感神經干經腹腔注射CCl4前后電生理變化

采用RM6280C多通道生理信號采集儀記錄交感神經電位發放。觀察神經纖維放電的情況,如放電的幅度、波形等變異性較大。在手術顯微鏡下分離神經纖維,直至放電較為單一為止,以使盡可能接近單纖維記錄:急性肝損傷造模前大鼠頸交感神經干放電波幅較低、頻率均一、電壓趨于平穩,經CCl4腹腔內注射行肝損傷刺激以后,交感神經干放電立刻增加、波伏增大,呈脈充式增強,持續記錄約5 min后,交感神經電活動回復正常時波形。剪斷交感神經干后,記錄波形立即消失,經兩斷端均無法再次測出。

2.3 肝組織內NE濃度

Coularray高效液相色譜-電化學法測定肝組織內NE濃度,不同處理組色譜圖見圖1,各組肝組織內去甲腎上腺素濃度實測值:正常對照組為(39.45±1.0)ng/mL,假手術組為(53.77±1.34)ng/mL,頸交感干離斷組為(45.98±0.76)ng/mL。頸交感干離斷組和正常組、shame組比較,差異非常顯著(P<0.01)。

結果說明:頸交感干離斷有效降低了肝組織內NE濃度;假手術組和頸交感干離斷組經CCl4行急性肝損傷造模處理后,肝組織內NE濃度均較正常對照組升高。

圖1 不同處理組色譜圖

2.4 頸交感神經干離斷對肝組織病理改變的影響

假手術組CCl4肝損傷后肝組織切片HE染色,肝組織充血明顯、匯管區炎性細胞浸潤明顯,肝細胞混濁、腫脹、壞死。頸交感神經干離斷后CCl4肝損傷后組織切片HE染色,肝組織充血、肝細胞混濁、腫脹較shame組明顯減輕,炎細胞浸潤較少。見圖2。

圖2 肝組織病理切片 HE 100倍

3 討 論

當前研究表明,肝臟的交感神經參與了肝臟的各種生理功能的調節,如肝臟的血液循環,糖代謝和酮體及膽汁的生成,尿素的排泌和氨的攝取等。肝臟交感神經的節后纖維主要來源于腹腔神經節和腸系膜神經節。交感神經調控系統由腹腔神經節、脊髓胸腰段、下丘腦交感中樞三個不同層次的中樞構成。Iwai M等的研究表明以刺激交感神經興奮活化增強可以加重肝損傷[7],夏鋒等研究表明,肝內去化學性交感神經可以顯著減輕CCl4所致的肝損害[8],但中樞交感神經系統對內臟器官功能活動調節的神經傳入和傳出通路一直沒有明確資料顯示,內臟器官的神經功能調控值得深入研究。

另有研究發現,大鼠頸交感干離斷(TCST)TCST可以降低Willis環動脈血中NE的含量、增加頸動脈血流。切斷頸上神經節前纖維而保存頸上神經節可以保證節后纖維不變性。下丘腦-垂體-腎上腺軸及頸交感干-下頜下腺軸在神經-內分泌-免疫系統的相互作用中起重要作用。頸交感神經干離斷后,減少了外周應激刺激向中樞的傳入,進而對交感-腎上腺系統的興奮具有抑制作用,可以減弱應激性刺激產生的交感神經中樞活化[9-10],同時可以干擾應激產生的交感-腎上腺髓質的反應,降低血漿兒茶酚胺水平,阻斷或改善隨后發生的一系列病理改變;四氯化碳在肝臟經細胞色素P450激活為自由基CCl3,攻擊肝細胞膜上的磷脂分子,繼而與膜脂質和蛋白質大分子進行共價結合,使蛋白質代謝障礙,引起膜結構和功能完整性的破壞。另外,CCl3可抑制細胞膜和微粒體膜上鈣泵的活性,使Ca2+內流增加。此兩種途徑最終導致肝細胞漿中可溶性溶酶滲出入血,引起一系列生化指標改變[11]。前白蛋白(PA)是一種半衰期較短而對肝細胞功能變化非常敏感的蛋白成分,能適時反應肝細胞的蛋白合成功能。

本組實驗結果顯示:本實驗中頸感神經傳入活動正常情況下趨于穩定發放,放電電壓和波幅較弱。在腹腔注射CCl4后頸交感干的生物電放電活動立即增強,波伏和頻率明顯增加,幾乎沒有潛伏期;我們認為可能系腹腔內交感神經末稍感覺纖維感受刺激后,神經沖動沿內臟大神經向上經交感神經節傳遞。最終經頸交感干的傳入刺激增多,致下丘腦交感中樞興奮增強,進一步激活交感-腎上腺系統,致血循環中兒茶酚胺增加。由此可能激活kupffer細胞活化,各種促炎因子表達上調,最終促炎和抗炎因子平衡失調,致組織細胞損害;反之離斷頸交感神經干后,阻斷或減弱交感中樞激活的外周信息傳入,下丘腦-垂體-腎上腺軸激活減弱,阻斷或改善隨后發生的一系列病理改變。

本試驗結果表明頸交感神經離斷在CCl4所致肝損傷有利于改善蛋白合成功能和膽紅素代謝,和降低血清AST、ALT。原因可能是在急性肝損傷的條件下,交感神經處于高緊張性狀態,從而起到高效的調控功能。一旦失去了這種調控作用則會產生功能失衡,引起代謝改變。而在基礎狀態下對代謝的調控功能則相對較低。另外,副交感神經的調控與交感神經存在著一種拮抗現象。它們共同對肝臟功能進行控制。交感神經中樞位于下丘腦的腹側正中,其生理功能偏向于異化代謝及分解作用。而副交感神經中樞位于下丘腦外側部,其生理功能偏向于同化作用。當交感神經活化減弱以后抑了異化作用,而使同化作用的趨勢占優,所以可使蛋白的合成加強。肝組織內去甲腎上腺素濃度在頸交感干離斷后較假手術組降低,結果說明頸交感干離斷有效降低了肝組織內去甲腎上腺素濃度,交感神經主要的神經遞質分泌受到了抑制。而肝組織內去甲腎上腺素水平在頸交感干離斷后較正常對照組增高,說明神經遞質的釋放同時受到體液因素和神經反饋調節,另外可能還有其它機制參與。

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