基于CD107a標記流式細胞儀檢測NK細胞毒性方法的建立

龔春香,王長榮,龔衛娟,胡茂志,季明春

(1.揚州大學醫學院免疫學教研室,江蘇揚州,225001;2.金壇市人民醫院,江蘇金壇,213200;3.揚州大學測試中心,江蘇揚州,225001)

NK細胞被稱為大顆粒淋巴細胞,是體內抗腫瘤、抗病毒感染的第一道防線。其胞漿內含有高濃度以囊泡形式存在的細胞毒性顆粒,如穿孔素、顆粒酶等[1]。溶酶體相關膜蛋白-1(LAMP-1或CD107a)是一種高糖基化的蛋白,約占溶酶體膜蛋白的50%[2-3]。NK細胞殺傷靶細胞時,毒性顆粒將到達漿膜面并與細胞膜融合,引起顆粒內容物釋放,最終導致靶細胞的死亡[4]。隨著脫顆粒的發生,CD107a分子被轉運到細胞膜表面,且CD107a分子的表達上調與穿孔素的分泌一致[5]。因此,CD107a分子陽性表達的NK細胞可代表具有殺傷活性的NK細胞。

長期以來,51Cr釋放實驗是檢測細胞毒活性的金標準,但51Cr具有半衰期短和放射性等缺點[6]。國內大多采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法,但表現出敏感性低的缺點[7],從而期待發展敏感、特異、安全、簡單、快捷的檢測細胞毒活性方法。本課題組曾建立穩定表達EGFP的K562細胞,將效應細胞與其作用后標記碘化丙啶(PI),計算PI和EGFP雙陽性細胞占總EGFP細胞的比例,作為一種評估NK細胞毒活性的方法[8]。在此我們利用CD107a分子反映NK細胞脫顆粒的特點,標記效應細胞,建立基于CD107a標記流式細胞儀分析NK細胞毒性的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人淋巴細胞分離液購自Axis-shield。熒光抗體CD56-FITC(MEM188),CD107a-PECy5(eBioH4A3)購自 eBioscience公司。佛波脂醇(PMA)、離子霉素購自Sigma。RPMI-1640培養基購自invitrogen公司,胎牛血清購自杭州四季青公司。LDH法檢測試劑盒CytoTox96 non-radioactive cytotoxicity assay購于Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:K562是高度未分化,不表達MHCⅠ類分子的人紅白血病細胞。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基懸細胞,37℃,5%CO2孵箱培養。

1.2.2 人PBMCs的分離:健康志愿者外周血用PBS緩沖液作等倍稀釋后,將細胞懸液與Ficoll分離液按體積比2∶1沿管壁緩慢加入至Ficoll分離液面上,室溫 2 000 rpm,15 min,緩慢增速,無制動停轉。吸取中間白霧狀細胞層,PBS緩沖液洗滌2遍,用RPMI-1640培養基懸浮,顯微鏡下計數。

1.2.3 流式細胞儀(FCM)分析NK細胞CD107a表達:用RPMI 1640完全培養基懸PBMCs,調整濃度為1×106/mL,K562細胞作為靶細胞。將PBMCs與K562以一定比例混合,置于U型孔,37℃CO2培養箱孵育2 h,加莫能菌素(monensin,2 μ mol/L)繼續孵育 3.5 h后加 PE-Cy5-CD107a、FITC-CD56抗體孵育半 h。PBS 緩沖液洗滌3次后,用200 μ L 1%多聚甲醛固定進行流式分析。PBMCs同時僅用佛波脂醇(PMA,2.5 μ g/mL)和離子霉素(Ionomycin,0.5 μ g/mL)刺激為陽性對照。

1.2.4 LDH釋放法分析NK細胞殺傷毒性:將不同稀釋度的PBMCs與對數期K562細胞按1:3、1:1、3:1的效靶比例混合,250 g離心4 min,37℃5%CO2孵箱培養4 h,收集上清,加入底物作用 30 min后,再加入終止液檢測各孔490 nm時的吸光度值。同時設靶細胞的自然釋放孔、最大釋放孔、培養基對照孔、體系效正孔、效應細胞自然釋放孔,每組細胞設4復孔。殺傷百分率=(實驗組-效應細胞自然釋放-靶細胞自然釋放)/(靶細胞最大釋放-靶細胞自然釋放)×100。

2 結 果

2.1 FCM 分析CD56和CD107a雙陽性細胞

外周血單個核細胞(PBMC)與K562細胞按3∶1相互作用后,按上述方法標記FITC-CD56和PE-Cy 5.5-CD107a抗體,FCM檢測熒光標記雙陽性細胞占總NK細胞的比例。同時,按相同方法標記設未加靶細胞的NK細胞,檢測其自發CD107a分子的表達,以單純PMA/Ionomycin刺激作為陽性對照。流式雙標記點圖中,(Q2/Q2+Q4)×100即表示 CD107a陽性的NK細胞頻率(%)。最終NK細胞毒性的計算方法=加靶細胞刺激的 CD107a陽性率(%)-CD107a自發表達率(%)。

2.2 CD107a抗體孵育時間對FCM檢測結果的影響

為阻止轉運到細胞膜表面的CD107a分子因膜內吞而降低檢測陽性率,Alter等使用莫能菌素抑制細胞膜的內吞。但同時莫能菌素抑制高爾基體介導的轉運,對細胞產生一定毒性[9]。如果CD107a抗體在PBMCs與K562細胞剛孵育時就加入培養體系,該抗體可能與很多低活性狀態NK細胞(細胞膜通透性增加)內囊泡上CD107a分子結合,導致檢測結果的假陽性。

因此我們首先觀察莫能菌素與PBMC孵育4 h對NK細胞CD107a標記的影響,在PBMC培養體系中(不含靶細胞)先加入CD107a抗體,1h后與莫能菌素孵育,4 h后標記CD56抗體FCM檢測,并與不加莫能菌素的PBMC進行比較。結果發現當培養體系CD107a抗體與莫能菌素孵育4 h后,CD107a抗體標記出現嚴重的假陽性(圖2),提示莫能菌素對細胞有一定毒性。

圖1 顯示FCM檢測CD56+CD107a+細胞的流式分析結果

圖2 長時間Monensin孵育引起C D107a標記假陽性

另外,我們對Alter等的方法進行改進,分為2組:第1組在PBMCs與K562混合孵育的同時加入CD107a抗體,2 h后加莫能菌素,再孵育2 h標記CD56抗體;另一組PBMCs與 K562混合,孵育2h加莫能菌素,孵育1.5h后同時標記CD107a和CD56抗體。結果顯示,第 1組 NK細胞的CD107a自發陽性率與加入 K562細胞的 CD56+CD107a+細胞頻率無明顯區別,而第2組NK細胞的CD107a自發陽性率明顯降低,加入靶細胞后CD56+CD107a+細胞頻率可達自發CD107a陽性率的8倍(圖3)。

圖3 CD107a抗體孵育時間對FCM檢測結果的影響

2.3 不同效靶比例對FCM檢測結果的影響

為觀察不同PBMCs與K562的比例對檢測結果的影響 ,分別以 2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1 、40∶1的比例按上述第2組方法檢測了2例不同正常個體,結果發現隨著效靶比例的增高,未觀察到CD56+CD107a+細胞頻率的明顯提高(圖4)。因此我們又深入分析PBMCs與K562細胞按3∶1、1∶1和1∶3的比例相互作用,發現隨著效靶比例的降低,CD56+CD107a+細胞頻率同樣相應降低(圖5),提示使用該方法檢測細胞毒活性時,并不需要較高的效靶比例就能得到明顯結果。

2.4 CD107a檢測法與傳統LDH釋放法的關聯

為觀察該實驗方法與傳統LDH釋放法檢測結果的一致性,取同一個體的外周血,分別用CD107a標記和LDH法評估NK細胞毒活性。結果發現,當效靶比例分別為1∶3、1∶1、3∶1 時,2 種方法均顯示殺傷效率隨之增高,而CD107a標記法的數值相應增高(圖6),提示該方法比LDH法更為敏感。

圖4 高效靶比對CD107陽性NK細胞頻率無明顯影響

圖5 低效靶比對CD107陽性NK細胞頻率正相關

圖6 CD107a標記法與LDH釋放法檢測結果一致

3 討 論

本研究基于NK細胞釋放其胞內穿孔素、顆粒酶的同時,CD107a分子向細胞膜遷移的現象,檢測CD107a陽性NK細胞的頻率以反映具有細胞毒活性NK細胞的頻率,從而間接反映NK細胞的殺傷活性。另外,該方法不僅被證明所需效應細胞少、比LDH釋放法敏感,還因改進CD107a抗體的孵育時間,降低了因莫能菌素的細胞毒性導致CD107a標記假陽性的現象。因此,我們在此成功建立一種基于CD107a標記而檢測NK細胞毒活性的實驗方法,具有簡單、快速、敏感的優點。

正常NK細胞表面幾乎不表達CD107a分子,但受靶細胞刺激后可大量表達于細胞膜表面[10],本實驗證實NK細胞膜表面CD107a自發表達的頻率很低,位于1.2%～5.8%。另外,因該方法主要涉及NK細胞膜表面CD107a的檢測,保持NK細胞活力以維持細胞膜完整性尤為重要。NK細胞胞漿內含有大量包裹顆粒酶的囊泡結構,這些細胞器的膜上均含有CD107a分子[11],如果NK細胞活力降低引起細胞通透性增加,則抗體分子將穿過細胞膜引起與胞內CD107a分子的結合,導致檢測結果的假陽性。我們證實雖然莫能菌素可抑制NK細胞膜的內吞,卻對NK細胞的活力產生一定影響,預先加入CD107a抗體長時間孵育將引起嚴重的背景染色(圖2),表現為Q1、Q2象限內均出現大量的CD107a陽性細胞。

為阻止因細胞膜內吞導致CD107a檢測的假陰性結果,莫能菌素的使用絕對必要。盡管Alter等采取NK細胞與靶細胞孵育時即加入CD107a抗體的方法,可從最大程度上保證CD107a分子檢測的陽性率,但容易引起假陽性。在本實驗檢測體系中,我們將效應細胞與靶細胞孵育2 h,充分刺激NK細胞后再加入莫能菌素,一方面降低莫能菌素對NK細胞的毒性,另一方面只要CD107a分子轉移至細胞膜,因莫能菌素抑制CD107a的內吞,加入CD107a抗體孵育半h即可與所有陽性結合,而不會出現檢測的假陰性。圖3顯示效靶細胞孵育后加入CD107a抗體標記,Q1象限內無明顯陽性細胞;而效靶細胞孵育前加入CD107a抗體標記,Q1象限出現大量陽性細胞(CD56-細胞的著色)。

雖然51Cr釋放法和LDH釋放法檢測敏感性不同,但所檢測對象均是靶細胞的死亡率,所以靶細胞的狀態對檢測特異性影響大。當靶細胞數目固定時,效靶比例越高,對靶細胞的殺傷活性越強,靶細胞死亡率越高。而CD107a標記法檢測的是效應(NK)細胞,當靶細胞數目固定時,在較低的效靶比例范圍內效應細胞越多,發揮殺傷活性的NK細胞數隨之增多。如果超出一定效靶比例時,效應細胞越多,CD107a陽性 NK細胞頻率并不隨之升高(圖4,5)。因此,CD107a標記法檢測細胞毒活性時僅需少量效應細胞,在檢測臨床標本時具有優越性。另外,由于CD107a分子在細胞表面的表達不受細胞因子分泌的影響[4],可通過流式細胞儀多色熒光標記同時分析NK細胞的細胞毒活性和細胞因子分泌情況。

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