杜氏鹽藻葉綠體轉化載體 pchlN-CAT-BAR的構建＊

曾 磊,潘衛東,王 翠,薛樂勛#

1)鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室鄭州 450001 2)鄭州大學基礎醫學院微生物學與免疫學教研室鄭州 450001

杜氏鹽藻葉綠體轉化載體 pchlN-CAT-BAR的構建＊

曾 磊1),潘衛東2),王 翠1),薛樂勛1)#

1)鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室鄭州 450001 2)鄭州大學基礎醫學院微生物學與免疫學教研室鄭州 450001

#通訊作者,男,1944年 2月生,本科,教授,研究員,研究方向:腫瘤標志物與基因工程,E-mail:xuelx@371.net

杜氏鹽藻;葉綠體轉化;chlN基因

目的:利用同源重組方法將外源選擇標記基因轉入杜氏鹽藻葉綠體中并表達。方法:以光非依賴性的原葉綠素酸酯還原酶 chlN基因為同源片段,以氯霉素乙酰轉移酶 (cat)基因和除草劑草丁膦 (PPT)抗性 bar基因為選擇標記,構建鹽藻葉綠體轉化載體 pchlN-CAT-BAR,并通過基因槍法轉入野生型鹽藻細胞,篩選轉化藻株。對轉化株和野生對照組的細胞計數結果進行統計學分析。結果:在 200 mg/L氯霉素的選擇下,野生型鹽藻 12 d左右死亡,轉化藻仍正常生長,再經 4 mg/L PPT繼代篩選 3～5代,得到表達氯霉素和 PPT抗性的鹽藻轉化株。鹽藻轉化株和野生株 1個月內藻株生長差異有統計學意義(P<0.05)。結論:以 chlN基因作為同源片段構建鹽藻葉綠體轉化載體是可行的。

ch lN基因與 chlL和 chlB一起編碼光非依賴的原葉綠素酸酯還原酶 (DPOR),三者任一的破壞都可阻斷葉綠素在黑暗條件下的合成,但鹽藻可通過光依賴的原葉綠素酸酯還原酶 (LPOR)合成葉綠素,不影響生存。作者以 chlN為同源片段[1],構建雙交換雙篩選轉化載體 pch lN-CAT-BAR,基因槍法轉入鹽藻葉綠體,以 cat、bar基因分別為主、輔篩選標記基因,用氯霉素 (Cm)、草丁膦 (PPT)進行篩選,旨在獲得具雙重抗性的轉化株,為以 chlN為同源片段在鹽藻葉綠體內表達外源蛋白提供依據。

1 材料與方法

1.1 藻株、菌株和載體 杜氏鹽藻 (D.salina1009)和大腸桿菌 DH5α均為該研究室保存。載體 pMDX-22、pTN1269、pMDN53及含 CAT表達盒 (以 aptA為啟動子、rbcL為終止子)的載體 pSP71-ARCAT、含 BAR表達盒 (以 aptA為啟動子、rbcL為終止子)的載體 pSP71-AR-BAR均由該研究室構建。

1.2 主要試劑及儀器 各種限制性內切酶、T4 DNA聚合酶、LA Taq酶、pMD18-T載體及 DNA連接試劑盒等均購自寶生物工程 (大連)有限公司,質粒DNA提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術 (杭州)有限公司,亞精胺購自 Solarbio公司,金粉購自 Bio-Rad公司,氯霉素 (Cm)購自上海生工生物工程技術服務有限公司,除草劑 PPT為該研究室保存。鹽藻液體培養基配方由以色列 Pick教授提供,經該研究室適當改良。PCR儀 (Biometra公司產品),DYY-8C電泳儀 (北京六一實驗儀器廠產品),凝膠成像儀 (Synoptics公司產品),HPG光照培養箱 (哈爾濱東明醫療儀器廠產品)。

1.3 接頭和引物 用 Primer Premier 5.0輔助設計引物,接頭引物及 PCR引物均由上海博尚生物技術有限公司合成,見表1。由北京博尚生物技術有限公司完成測序工作。

表1 引物序列

1.4 葉綠體轉化載體 pchlN-CAT-BAR的構建、轉化及篩選方法

1.4.1 載體 pch lN-CAT-BAR的構建 以 pTN1269為模板,N1269-X53 upSm aⅠ和 N1269 down為引物,pMDN53為模板,N1269-X53 downHindⅢ和 X53 up為引物,分別進行 PCR擴增,以 2種回收產物為模板,N1269-X53 upSm aⅠ和 N1269-X53 downHindⅢ為上下游引物,連接 PCR擴增,得到載體 pMD-chlN1269-53,含 chlN基因 3’端編碼區及其下游非編碼區片段 chlN-53。

EcoRⅠ和SmaⅠ雙切載體 pMDX-22,T4 DNA聚合酶補平自連,由BglⅡ和HindⅢ雙酶切后,與 ch lN22-53adp tA和 chlN22-53 adptB制備的接頭 (BamHⅠ黏端-EcoRⅤ-SacⅠ-KpnⅠ-SalⅠ-SmaⅠ-HindⅢ黏端 )連接 ,得到載體 pUCX-22。HindⅢ和SmaⅠ雙切 pUCX-22連接chlN-53片段,得到載體 pUCchlN,連接 CAT表達盒片段,得到載體 pch lN-CAT,連接 BAR表達盒片段,得到載體 pchlN-CAT-BAR。

1.4.2 供體質粒 DNA的大量制備和 PEG法純化按分子克隆試驗指南[2]進行。

1.4.3 鹽藻受體細胞準備 野生型鹽藻以 (5～6)×105mL-1接種于液體培養基,26℃明暗周期(12 h∶12 h),4 500 Lux光照培養 10 d至對數生長中后期。取 3 mL藻液 [約 (6～7)×106mL-1],2 000g離心 3min,棄上清,留 200μL重懸藻體,均勻涂布于固體平板培養基表層,靜置 15min,密封后光強 3 000 Lux倒置培養 2 h,無菌鏟挖出直徑 2～3 cm、鹽藻涂層均勻的小塊,置無菌培養皿中央,以備轟擊。

1.4.4 基因槍子彈制備及轉化 過程見文獻[3],每個樣品轟擊 1～3次不等。

1.4.5 過渡培養 轟擊后將樣品分為 4組:野生型對照組 (不轟擊 )、組 1(轟擊 1次 )、組 2(轟擊 2次)、組 3(轟擊 3次),置光照培養箱,26℃,光強300 Lux,明暗周期 (12 h∶12 h)培養 24 h,2 mL培養液洗脫瓊脂表面鹽藻,26℃300 Lux弱光培養8～12 h,其后 3 000 Lux光照培養 24 h,加 Cm至100 mg/L,進行過渡培養。

1.4.6 篩選培養 過渡培養 1～2 d后,用培養液調節密度至 1×106mL-1左右,補加 Cm至 200 mg/L,光強 4 500 Lux進行篩選培養,并以此為起點,每2 d計數 1次,記錄鹽藻生長情況。15 d后視情況加入終質量濃度 4 mg/L PPT進行 Cm、PPT雙篩選。

1.5 各組存活藻量的計數檢測 4組待篩選藻株,每組隨機抽取 9個樣本于同一時間進行細胞計數,隔天 1次,至第 32天。每個樣本計數 3次,根據公式 N=S/4×104×K(N為 1 mL藻液中存活的藻細胞個數,S為細胞計數板位于 4角的 4個大格的細胞總數,K為稀釋倍數),求出不同培養時間每個樣本每mL藻液中的活藻數量均值。

1.6 統計學處理 采用 SPSS 17.0進行統計分析,應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較葉綠體轉化后 1個月內藻株增殖情況,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 葉綠體轉化載體 pchlN-CAT-BAR的構建載體 pMDX-22含 chlN基因 5’端區域及其上游序列 ,長 2 742 bp,pTN1269、pMDN53分別含 chlN基因 3’端編碼區 1 269 bp及其下游非編碼區 532 bp。三者經構建得到含 ch lN基因 5’端區域及其上游序列 (2.2 kb),編碼區 3’端及下游非編碼區 1.8 kb的載體 pUCchlN。載體 pSP71-AR-CAT含有 CAT表達盒,其表達元件為萊茵衣藻葉綠體啟動子 atpA及終止子 rbcL,可在鹽藻葉綠體中進行轉錄,使受體細胞表達 Cm抗性。1.8 kb的 CAT表達盒插入以chlN基因及其兩側序列為同源片段的載體 pUC-chlN,得到含 Cm抗性的載體 pchlN-CAT,在 CAT盒下游插入含同樣表達元件 1.8 kb BAR表達盒,得到10.2 kb可使轉化藻表達 Cm和 PPT雙重抗性的載體 pch lN-CAT-BAR。酶切鑒定結果見圖1。

圖1 質粒載體的酶切鑒定結果M:DNA LadderMarker;1:pMDX-22/BglⅡ +Sm aⅠ;2:pUCX-22/SacⅠ;3:pMDch lN1269-53/HindⅢ +Sm aⅠ;4:pUCchlN/HindⅢ +SmaⅠ;5:pch lN-CAT/EcoRⅤ +SacⅠ;6:pchlNCAT-BAR/Sm aⅠ。

2.2 鹽藻葉綠體轉化及初步篩選 培養時間內鹽藻增殖情況見表2。在 Cm質量濃度補至 200 mg/L后,野生型對照組增殖速度逐漸降低,細胞數量減少,12 d后全部死亡;轉化藻株則繼續生長,表現出Cm抗性,與組 1、組 3相比,組 2增殖略好。野生型藻株不含 cat基因,無 Cm抗性,最先死亡;組 1轟擊1次,雖然藻體損傷小,但外源基因轉入少,增殖趨勢平緩;組 3轟擊 3次,藻體損傷大,早期增殖緩慢,甚至有下降趨勢,但 cat基因轉入相對多,后期增殖速度較快;組 2藻體損傷、轉入基因量介于組 1、組 3間,故增殖相對較好。顯微鏡 (×1 000)下可觀察到,在含 Cm的培養液中,藻株增殖受到抑制,藻體變型呈細長保齡球狀,運動減緩,略有黃化,部分裂解死亡,與轉化藻相比,野生型藻受損傷更嚴重。15 d后加入終質量濃度為 4 mg/L的 PPT繼代培養,5 d后發現鹽藻不受 PPT抑制,仍然存活并已繼續增殖 3～5代。由此可知,轉化藻株表達 Cm和 PPT抗性。

表2 葉綠體轉化后 1個月內藻株增殖情況 (n=3) ×106mL-1

3 討論

葉綠體轉化系統近年來逐步發展完善,與核系統相比,突出優勢在于基因拷貝數多,同質化完成目的基因可隨葉綠體基因復制遺傳并使目標蛋白超量表達,產量可比核轉化高 20倍以上,甚至可達100～300倍[3],另外葉綠體為母系遺傳,具有相對封閉性,外源基因擴散風險低[4],對表達產物耐受性高。研究[4-5]證明,與核系統相比,葉綠體雖不能完成蛋白質的糖基化,但能夠正確折疊和組裝復雜的哺乳動物蛋白,還可正確添加二硫鍵,產生有活性的目標蛋白,這也是葉綠體不同于原核系統而更類似于真核系統的一個特征。在蛋白表達方面,葉綠體基本可認為是與內質網相當的蛋白表達機構。隨著研究深入,葉綠體重組蛋白表達量增多。近來 Wang等[6]得到重組人類谷氨酸脫羧酶 65,具有抗原性并可在轉基因藻株中積累,含量占總可溶蛋白的0.25%～0.30%,Manuell等[7]用哺乳動物牛乳腺血清淀粉樣蛋白的編碼區來替代葉綠體 psbA編碼區,得到表達量大于總蛋白 5%的重組蛋白,這說明利用藻類葉綠體作為新型生物反應器生產有活性的哺乳動物蛋白具有良好的應用前景。

作者以鹽藻葉綠體為生物反應器,構建雙交換雙篩選轉化載體 pchlN-CAT-BAR,基因槍法轉入鹽藻細胞,在 Cm、PPT雙重選擇壓力下,對細胞進行計數,檢測到葉綠體內 cat、bar基因的表達,初步確定以 chlN基因為同源片段構建鹽藻葉綠體轉化載體是可行的,而基因表達的最終目的是蛋白的富集[8],為以 chlN基因為同源片段在鹽藻葉綠體內高效表達外源蛋白提供先決條件,為日后建立穩定的鹽藻葉綠體表達系統,批量生產具有生物活性的外源蛋白,甚至擴大運用至生產實踐提供了基礎。

葉綠體系統相對于核系統有諸多優點,但技術上也存在瓶頸。轉化效率一般比核轉化低 10～100倍,這主要有兩個原因:一是外源片段通過同源重組定點整合入葉綠體,因插入位點可控,較少發生基因失活、基因沉默等現象,但由于插入位點的局限性,轉化效率遠低于通過隨機整合實現轉化的核系統。所以,同源片段的選擇至關重要,一般來說需要:①足夠的長度;兩端同源臂長度均在 1～2 kb較好[9]。②合適的插入位點,插入不能損傷葉綠體功能或影響宿主生存。③與內源片段同源性高,確保重組后序列不發生變化。葉綠體序列資料的缺乏使得絕大多數物種的轉化難以實施,目前已得到鹽藻葉綠體基因組全序列 (GenBank號:GQ250046.1),全長269 044 bp,這將大大加快鹽藻葉綠體轉化系統的研究和應用。作者選取 chlN基因為同源片段,失活后不影響正常生存,鹽藻仍可在光培養條件下通過LPOR合成葉綠素,而且構建的同源臂分別為2.2和 1.8 kb,長度適中,保證整合效率。

另一個制約轉化的主要因素為葉綠體基因組的同質化程度。同質化過程是使所有基因組都帶有目的片段的過程,此時轉化子抗性逐步提高,選擇壓力過小,則不能除去未轉化的基因組;過大,則可導致宿主迅速死亡。作者選用鹽藻敏感的 Cm及 PPT作為篩選試劑[3],cat、bar基因為篩選標記。Cm較溫和,篩選周期長,為 10 d左右;PPT致死性強,1 mg/L就明顯抑制鹽藻增殖,4 mg/L培養 3～5 d即可觀察到鹽藻細胞的白化和死亡[3]。

總之,鹽藻葉綠體轉化系統環境安全性高,外源蛋白耐受性好,獲得產物多數具有生物活性,表達量還在逐漸增多,可以解決傳統轉化系統存在的一些問題,具有廣闊的發展前景。

致謝 河南省分子醫學重點學科開放實驗室。

[1]范國昌,蘇寧,張中林,等.同源重組置換衣藻葉綠體chlL基因及其同質化鑒定[J].中國生物化學與分子生物學報,2000,16(1):72

[2]Sambrook J,RussellD.分子克隆實驗指南[M].黃培堂譯.3版.北京:中國科學出版社,2002:32-35,48

[3]潘衛東.杜氏鹽藻 (Dunaliella salina)葉綠體轉化研究[D].鄭州:鄭州大學,2003.

[4]Mayfield SP,ManuellAL,Chen S,et al.Chlamydomonas reinhardtii chloroplasts as protein factories[J].Curr Opin Biotechnol,2007,18(2):126

[5]DaniellH,Chebolu S,Kumar S,et al.Chloroplast-derived vaccine antigens and other therapeutic proteins[J].Vaccine,2005,23(15):1 779

[6]Wang X,Brands ma M,Tremblay R,et al.A novel expression platform for the production of diabetes-associated autoantigen human glutamic acid decarboxylase(hGAD65)[J].BMC Biotechnol,2008,8:87

[7]ManuellAL,BeligniMV,ElderJH,et al.Robust expression of a bioactive mammalian protein in Chlamydomonas chloroplast[J].PlantBiotechnol J,2007,5(3):402

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(2010-01-07收稿 責任編輯趙秋民)

Construction of transfor mation vector pch lN-CAT-BAR for chloroplast ofDunaliella salina

ZENG Lei1),PAN W eidong2),WANG Cui1),XUE Lexun1)
1)Laboratory forCellB iology,Departm ent of B ioengineering,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001
2)Departm ent of Imm unology and M icrobiology,College of B asicM edical Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001

Dunaliella salina;chloroplast transformation;chlN

A im:To transfer and express exogenous selectivemark genes in the chloroplastofDunaliella salina(D.salina)by homologous recombination.Methods:By using chloramphenicol acetyltransferase gene(cat)and herbicide phosphinothricin(PPT)resistant gene(bar)as selective mark genes,and the ch lN,one of light-independent protochlorophyllide reductase genes,as homologous segment,a transfor mation vector pchlN-CAT-BAR for the chloroplast ofD.salinawas constructed,and introduced into the wild type cells ofD.salinaby microprojectile delivery.Results:The transfor mants ofD.salinasurvived under the selection pressure of chloramphenicol at 200 mg/L,while the wild type cells died about 12 days after the transfor mation.The stable transformantswere obtained by the selection of 4 mg/L PPT for 3～5 generations.The statistical analysis showed that therewas a significant difference in proliferation between transformants andwild-type cells ofD.salinaunder the selected pressures(P<0.05).Conclusion:It is available to construct transformation vector forD.salinachloroplast using the chlN gene as homologous segment.

Q782

＊科技部國際科技合作項目 2007DFA01240;國家自然科學基金資助項目 30300208