杜氏鹽藻 cDNA文庫的構建及 KCBP基因的克隆＊

柳麗平,李 杰,王 翠,閻赟夢,薛樂勛

鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室鄭州 450001

杜氏鹽藻 cDNA文庫的構建及 KCBP基因的克隆＊

柳麗平,李 杰,王 翠,閻赟夢,薛樂勛#

鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室鄭州 450001

#通訊作者,男,1944年 2月生,研究員,研究方向:生物工程,E-mail:xuelx@371.net

杜氏鹽藻;cDNA文庫;類驅動蛋白鈣調素結合蛋白

目的:構建杜氏鹽藻 cDNA文庫并從該文庫中篩選類驅動蛋白鈣調素結合蛋白 (KCBP)基因 cDNA序列。方法:取對數生長期的杜氏鹽藻細胞,提取總 RNA并分離純化 mRNA,反轉錄合成雙鏈 cDNA,連接到 pAP3neo載體上,采用電轉化法將重組質粒轉化大腸桿菌DH10B。計算平板上單菌落數,測定文庫的滴定度和重組率。運用 PCR法篩選含有 KCBP基因特異片段的質粒。結果:文庫滴定度為 5.6×106pfu/mL,重組率在 90%左右,插入片段長度在 0.4～6.0 kb,平均長度為 1.9 kb。利用 PCR法從該文庫中篩選到了含有新基因 KCBP特異片段的單菌落,經測序與 cDNA末端快速擴增 (RACE)-PCR獲得的杜氏鹽藻 KCBP基因 cDNA序列相符,此序列屬于 kinesin-14家族。結論:成功構建杜氏鹽藻 cDNA文庫,并從該文庫篩選出一個kinesin樣 cDNA序列。

運用藻類基因工程手段可以構建高產、優質、抗逆的藻類新品種,生產燃料、降解污染物[1]以及構建藻類表達系統以生產大量廉價的蛋白和藥物來研究并治療人類疾病。作為單細胞生物的杜氏鹽藻具有沒有細胞壁、培養條件簡單等許多獨特優點[2-3],這使它不但可以作為一種新型的生物反應器宿主,而且可以作為模式生物用于對其他物種基因工程表達調控等方面的研究。cDNA文庫包含了生物體表達的全部基因信息,是獲取未知功能基因的有效技術手段,也是系統研究生物基因結構和功能的基礎[4]。構建杜氏鹽藻 cDNA文庫,可用于篩選相關目的基因,在克隆新基因以及基因功能分析研究等方面發揮重要作用,更有利于利用基因工程技術對杜氏鹽藻進行改造來生產所需的外源性蛋白。作者構建了杜氏鹽藻 cDNA文庫并從中篩選到類驅動蛋白樣鈣調素結合蛋白(kinase like calmodulin-binding protein,KCBP)基因,獲得該基因的 cDNA序列全長。

1 材料與方法

1.1 材料 該實驗室培養的處于對數生長期的新鮮杜氏鹽藻,Trizol細胞裂解液購自 Promega公司,Mag-Bind mRNA純化試劑盒購自美國 OMEGA公司,cDNA文庫構建試劑盒購自大連寶生物公司,5’-RACE和 3’-RACE試劑盒購自美國 Ambion公司,其他常規試劑均為分析純。

1.2 cDNA文庫的構建 取 200 mL處于對數生長期的杜氏鹽藻細胞,用 Trizol法提取總 RNA,用乙醇和高濃度冰冷的氯化鈉沉淀分離所得的總 RNA,用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量,并用分光光度計測量其純度,用Mag-Bind mRNA試劑盒分離純化 mRNA。用M-MLV RTase合成雙鏈 cDNA,取 0.5μL用 10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測雙鏈 cDNA的質量。按照試劑盒要求,每 12.5μL cDNA溶液用 3.5μLEcoR I-Sm aI Adaptor(0.4 g/L)、10 ×T4 DNA Ligase Buffer 2μL 、T4 DNA Ligase(350 U/μL)2μL混勻后 8℃過夜反應 (16 h以上),加入NotⅠ27μL、EcoRⅠ (50 U/μL)3μL混勻 ,37 ℃反應 3 h使 cDNA末端平滑化;用層析柱除去小于 400 bp的短鏈 cDNA,然后與 pAP3neo載體連接并電轉化到大腸桿菌DH10B感受態細胞中。

1.3 文庫質量鑒定 計算平板上單菌落數,測定文庫的滴定度和重組率。隨機挑取 13個單菌落,用試劑盒中的 T3(5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGCG-3’)和 T7(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)引物進行 PCR擴增,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測插入片段的大小。PCR擴增程序:95℃預變性 1min;94℃變性 30 s,55℃退火 30 s,72℃延伸 3min,30個循環;72℃延伸 10min,4℃停止。

1.4 兼并引物的設計與 RACE法擴增 KCBP基因從 GenBank上搜索已登錄的 KCBP氨基酸序列并進行序列比對,根據其在萊茵衣藻、綠藻等物種中的保守性,找出兩段保守性高、兼并性低的序列 D IMQFG和 CIFAYG,設計一對兼并引物 F30[5’-GA(T/C)AT(T/C/A)ATGCA(A/G)TT(T/C)GG-3’]和 R30[5’-CC(A/G)TA(A/C/G/T)GC(A/G)AA(A/G/T)AT(A/G)CA-3’],引物由北京博尚生物工程公司合成。提取對數期杜氏鹽藻總 RNA,反轉錄 cDNA,RT-PCR擴增得到 KCBP片段,使用 RACE試劑盒擴增得到 KCBP 3’端與 5’端序列,經拼接得到KCBP基因全長。

1.5 cDNA文庫的快速篩選 挑取 10個轉化子單菌落為一組,接種到一個含有氨芐青霉素的 LB培養基試管中,培養 8 h。5管約 50個轉化子為一個轉化子池,每管取 100μL培養物混合,收集菌體并提取質粒,溶于 100μL dH2O中。取 0.5μL質粒用引物F30、R30進行 KCBP基因的特異 PCR檢測。篩選出陽性轉化子池,然后再對陽性轉化子池中的單個轉化子進行 PCR篩選,直至獲得陽性轉化子。將陽性轉化子的菌液送北京博尚生物工程公司測序。

2 結果

2.1 總 RNA及雙鏈 cDNA的質量 瓊脂糖凝膠電泳檢測總 RNA:得到 28S和 18S兩條清晰的條帶,亮度大約是 2∶1。紫外分光光度計測定A(260 nm)/A(280 nm)為 1.98。雙鏈 cDNA經 10 g/L瓊脂糖凝膠檢測,形成彌散條帶,長度 0.1～3.0 kb(圖1)。

圖1 雙鏈 cDNA電泳檢測M:DL 10 kb;1:雙鏈 cDNA。

2.2 文庫滴定度 文庫滴定度為 5.6×106pfu/mL,重組率在 90%左右。對隨機挑取的克隆進行PCR擴增,經 10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測插入片段的大小,結果得到 0.4～6.0 kb不等的片段 (圖2),平均插入片段長度為 1.9 kb。

圖2 隨機挑取克隆的 PCR結果1～13:隨機挑取的 13個克隆的 PCR產物;M:DL 10 kb。

2.3 兼并引物 PCR擴增 利用兼并引物進行 PCR反應獲得了 1 350 bp的條帶 (圖3),測序后與其他物種比對,發現其與衣藻中 KCBP基因的同源性高達 83%,與其他物種也有 50%～80%的同源性,可認為得到鹽藻 KCBP基因部分片段。

圖3 兼并引物 PCR擴增產物M:DL 10 kb;1:PCR產物。

2.4 新基因的篩選 PCR法篩選陽性轉化子池,出現 1 350 bp的目的條帶;同時對陽性轉化子池內的轉化子再次進行 PCR,仍然出現目的條帶的轉化子為陽性轉化子 (圖4,5)。陽性轉化子經測序,結果與通過 RACE-PCR擴增所得 KCBP基因全長 cDNA序列完全相符。該基因全長 4 514 bp,讀碼框長度為 3 816 bp,其中包含MyTH4結構域、FERM_M結構域和Motor結構域等。該序列已提交 Gen-Bank(登錄號為 GU345802)。

3 討論

構建高質量的 cDNA文庫的基礎和前提是提取到高質量的 mRNA。作者采用 Trizol法提取到了較為完整的mRNA。由于杜氏鹽藻中富含多糖和酚類物質,它們易與 RNA結合,影響 RNA質量[5],因此常規 RNA提取結果均不是很理想。作者采用乙醇沉淀和高濃度冰冷的氯化鈉雙重沉淀后才進行 cDNA雙鏈的合成,從而極大地降低了多糖和酚類物質的影響。同時,層析柱分級分離 cDNA也很關鍵,短片段過多會影響連接轉化效果和文庫質量。轉化體系中所加入的目的片段不能超過 4.0μL,過多會導致轉化效率降低。文庫滴度、重組率和插入片段的大小是鑒定 cDNA文庫質量的重要標準[6]。作者構建的文庫滴定度為 5.6×106pfu/mL,重組率為 90%左右,插入片段的平均長度為 1.9 kb,這些數據完全滿足了構建完整文庫的要求,同時,從構建的文庫中獲得的 KCBP基因全長 cDNA序列,與 RACE-PCR所得序列完全相符,說明成功構建了杜氏鹽藻 cDNA文庫。

該文庫中驗證并篩選到的 KCBP為 kinesin-14家族的一個成員。Kinesin參與鞭毛微管的組裝。KCBP在擬南芥中首次發現[7],它是唯一含有結合鈣調素結構域的驅動蛋白。起初認為 KCBP僅存在于被子植物中,近來發現其同源物在裸子植物 (挪威云杉)和綠藻 (萊茵衣藻和桿形裂絲藻)中也存在。KCBP基因全長的克隆為研究其在杜氏鹽藻鞭毛生長中的作用及其細胞內運輸功能的作用機制奠定了基礎。在綠藻的很多成員中細胞分裂的模式與開花植物不同,在胞質分裂期間藻膜體取代成膜體,在這些類群中 KCBP的存在提示其在藻膜體的形成中也起重要作用。在海膽中也報道過有一個KCBP存在[8],但是這個基因缺失 KCBP特有的MyTH4和類踝蛋白結構域。到目前為止,KCBP及其同源物在哺乳動物、真菌、果蠅或秀麗隱桿線蟲中還沒有發現[9]。因此,真正的 KCBP及其同源物僅出現在植物和綠藻中。

[1]馮書營,劉紅濤,李杰,等.杜氏鹽藻基因工程研究現狀及應用前景[J].中國生物工程雜志,2007,27(2):108

[2]AvronM,Ben-AmotzA.Dunaliella:physiology,biochemistry and biotechnology[M].Florida:CRV Press,1992:150

[3]Walker TL,Purton S,Becker DK,et al.Mocroalgae as bioreactors[J].Plant Cell Rep,2005,24(11):629

[4]楊全,張卉,王文全,等.甘草根 cDNA文庫構建與分析[J].中國中藥雜志,2008,33(12):1 386

[5]Schneiderbauer AH,Sandermann H Jr,Ernst D.Isolation of functional RNA from plant tissues rich in phenolic compounds[J].AnalBiochem,1991,197(1):91

[6]楊成君,王軍,劉關君,等.紅果人參葉中 cDNA文庫的構建[J].植物生理學通訊,2007,43(4):664

[7]ReddyAS,Narasimhulu SB,Safadi F,et al.A plant kinesin heavy chain-like protein is a ca lmodulin-binding protein[J].Plant J,1996,10(1):9

[8]Rogers GC,Hart CL,Wedaman KP,et al.Identification of kinesin-C,a calmodulin-binding carboxy-terminal kinesin in animal(Strongylocentrotus purpuratus)cells[J].MolBiol,1999,294(1):1

[9]Abdel-Ghany SE,Day IS,S immonsMP,et al.Origin and evolution of kinesin-like calmodulin-binding protein[J].J Plant Physiol,2005,138(3):1 711

(2010-01-07收稿 責任編輯王 曼)

Construction of cDNA library ofDunaliella salinaand cloning of kinesin like calmodulin-binding protein gene

L IU L iping,L I Jie,WANG Cui,YAN Yunm eng,XUE Lexun
Laboratory for Cell B iology,Departm ent of B ioengineering,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001

Dunaliella salina;cDNA library;kinesin like calmodulin-binding protein

A im:To construct the cDNA libraryofDunaliella salinaand clone a new gene,kinesin like calmodulin-binding protein(KCBP).Methods:Total RNA was isolated and purified fromDunaliella salina.cDNA was then synthesized fromisolated mRNA and ligated into the pAP3neo predigested vector.The recombinant plas midswere transformed intoEscherichia coliDH10B by electroporation.Then the titers and recombinant rateswere determined by the number of single clones.KCBP was screened from the cDNA plas mid library ofDunaliella salinaby PCR.Results:The titer of the cDNA librarywas 5.6×106pfu/mL,the recombination rate was about 90%,the sizes ofmost inserted fragments ranged from 0.4 to 6.0 kb with an average size of 1.9 kb.The screened gene KCBP belonges to kinesin-14 family.Conclusion:KCBP is cloned and screened successfully from the cDNA library ofDunaliella salinaconstructed in this study.

Q781

＊國家自然科學基金資助項目 30700014;科技部國際科技合作基金資助項目 2007DFA01240