重組慢病毒載體 pLKO-1-EGFP-puro的構(gòu)建＊

宋 波,韓志強(qiáng),吳少璞,劉景偉,蔡曉輝,楊 靖,許予明

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄭州 450052

重組慢病毒載體 pLKO-1-EGFP-puro的構(gòu)建＊

宋 波,韓志強(qiáng),吳少璞,劉景偉,蔡曉輝,楊 靖,許予明#

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄭州 450052

#通訊作者,男,1962年 10月生,博士,教授,研究方向:腦血管病的基礎(chǔ)與臨床,E-mail:xuyuming@zzu.edu.cn

神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病;慢病毒載體;綠色熒光蛋白;嘌呤霉素抗性

目的:構(gòu)建具有綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記及嘌呤霉素 (puro)抗性的重組慢病毒載體。方法:改建慢病毒載體質(zhì)粒 pLKO-1-puro的多克隆位點 (MCS),以質(zhì)粒 pEGFP-C3為模板擴(kuò)增出 CMV-EGFP并與 pLKO-1-puro連接,形成重組的慢病毒載體質(zhì)粒 pLKO-1-EGFP-puro,后者與包裝質(zhì)粒Δ8.2和包膜蛋白質(zhì)粒 VSV-G在 293T細(xì)胞中進(jìn)行包裝,產(chǎn)生重組慢病毒顆粒,感染非洲綠猴腎細(xì)胞 Vero細(xì)胞,觀察 GFP的表達(dá)。結(jié)果:成功改建了慢病毒載體質(zhì)粒 pLKO-1-puro并插入了 CMV-EGFP,形成了新型慢病毒載體質(zhì)粒 pLKO-1-EGFP-puro。3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞產(chǎn)生的重組慢病毒顆粒感染Vero細(xì)胞后高表達(dá)綠色熒光。結(jié)論:成功構(gòu)建了高效的帶 GFP報告基因及嘌呤霉素抗性的慢病毒載體。

基因治療在神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景,其關(guān)鍵在于選擇合適的基因轉(zhuǎn)移載體,但神經(jīng)元為不分裂細(xì)胞的特性限制了眾多載體的應(yīng)用。慢病毒載體 (lentiviral vector)源于 H IV-1[1-2],不僅能夠感染非分裂期細(xì)胞,還可通過整合穩(wěn)定表達(dá)多個轉(zhuǎn)錄啟動子,在神經(jīng)系統(tǒng)基因治療中具有其他載體難以比擬的優(yōu)勢。作者構(gòu)建了高效的帶綠色熒光蛋白 (green fluorescent protein,GFP)及抗生素嘌呤霉素 (puromycin,puro)抗性篩選的慢病毒載體,報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 各種限制性內(nèi)切酶、PrimeStar DNA聚合酶、DNA連接試劑盒和 DNA Marker均購自日本 TaKaRa公司,質(zhì)粒小量提取試劑盒和 PCR清潔試劑盒購自美國 Axygen公司,DNA純化回收試劑盒購自德國 Qiagen公司,脂質(zhì)體 2000購自美國 Invitrogen公司,Polybrene購自美國 Sigma公司,胎牛血清 (FBS)購自杭州四季青生物工程公司,高糖DMEM和胰蛋白酶購自美國 Gibco公司。

1.2 質(zhì)粒、菌株及包裝細(xì)胞 慢病毒載體質(zhì)粒 pLKO-1-puro(含 puro抗性基因及多克隆位點)、包裝質(zhì)粒Δ8.2,含人巨細(xì)胞病毒早期啟動子 (CMV)和來自胰島素基因的 Poly(A)位點、包膜蛋白質(zhì)粒VSV-G(編碼水皰性口炎病毒 G糖蛋白)、質(zhì)粒 pEGFP-C3(含以 CMV為啟動子的增強(qiáng)型 GFP基因,CMV-EGFP)。人胚腎細(xì)胞 293T以及非洲綠猴腎細(xì)胞Vero細(xì)胞均由美國華盛頓大學(xué)內(nèi)分泌系 Thomas J.Baranski教授惠贈。大腸桿菌 DH5α為鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗中心保存。

1.3 pLKO-1-puro質(zhì)粒多克隆位點(MCS)的改建設(shè)計新的 MCS,包含 5個單酶切位點AgeⅠ、EcoRⅠ、XbaⅠ、SalⅠ和M luⅠ,序列為 MCS1:5’-CCGGT GAATTCTCTAGAGTCGACACGCGT-3’(帶AgeⅠ黏端 ),MCS2:5’-AATTACGCGTGTCGACTCTAGAG AATTCA-3’(帶EcoRⅠ黏端),送交上海生工生物公司合成。將 pLKO-1-puro質(zhì)粒應(yīng)用AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切 (反應(yīng)條件為 37℃水浴 90min,70℃滅活20min),電泳取約 7 000 bp的長片段,再與退火互補(bǔ)后的黏性MSC序列應(yīng)用 DNA連接試劑盒連接(反應(yīng)條件為 16℃水浴 18 h),分別以B amHⅠ和XbaⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.4 CM V-EGFP片段的擴(kuò)增 以 pEGFP-C3為模板,設(shè)計并合成上下游引物分別為:5-’TGTCGAC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGG-3’(含SalⅠ酶切位點 ),5’-TACGCGTGCGTTAAGATACATT GATGAGTTTGGAC-3’(含M luⅠ酶切位點 ),用PrimeStarDNA聚合酶實行 PCR(參數(shù)設(shè)定:94℃4min;94℃30 s,58℃30 s,72℃2min,30個循環(huán);72℃5min,4℃保存),得到 CMV-EGFP片段,預(yù)計約為 1.6 kb。

1.5 重組慢病毒載體質(zhì)粒 pLKO-1-EGFP-puro的克隆 分別用SalⅠ和M luⅠ雙酶切上述改建的含 5個新 MCS的 pLKO-1-puro質(zhì)粒和 CMV-EGFP片段(37℃水浴 3 h,70℃滅活 20min),采用 DNA連接試劑盒連接上述雙酶切的膠回收產(chǎn)物 (16℃水浴18 h)。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH5α,挑取陽性菌落,擴(kuò)增后提取質(zhì)粒。SalⅠ和M luⅠ雙酶切鑒定(37℃水浴 2 h),預(yù)計得到 1.6 kb片段。

1.6 重組慢病毒載體 pLKO-1-EGFP-puro的包裝及濃縮 具體方法參照文獻(xiàn)[3]。采用磷酸鈣沉淀法將載體質(zhì)粒 pLKO-1-EGFP-puro與包裝質(zhì)粒Δ8.2和包膜蛋白質(zhì)粒 VSV-G[m(Δ8.2)∶m(VSV-G)=8∶1]共轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染 12 h后更換完全培養(yǎng)基,72 h后收集上清液,0.45μm無菌濾器過濾后得病毒原液。將病毒原液在 Beckman超速冷凍離心機(jī)中 25 000 r/min 4℃離心 90min,棄上清液,再以原液 1/10體積的 PBS重懸沉淀,每 15min以微量移液器輕輕吹打,2 h內(nèi)使病毒顆粒充分懸浮,得到病毒濃縮液。整個過程在冰水混合物中進(jìn)行,分裝后 -80℃凍存。

1.7 病毒感染效率的測定 在 37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中用高糖 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)Vero細(xì)胞,細(xì)胞達(dá) 80%匯合后傳代。收集適量的處于對數(shù)生長期的 Vero細(xì)胞 (105mL-1),加入96孔板中,每孔約 100μL,每孔再加入不同稀釋倍數(shù)的病毒濃縮液,48 h后熒光顯微鏡下觀察 GFP的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 改建 pLKO-1-puro質(zhì)粒的鑒定 改建的 pLKO-1-puro經(jīng)EcoRⅠ、XbaⅠ、SalⅠ、M luⅠ和B amHⅠ組合雙酶切后各得到一條約 7 000 bp的大片段和一條約 750 bp的小片段,與預(yù)期結(jié)果相符。見圖1。

圖1 pLKO-1-puro質(zhì)粒MCS改建雙酶切鑒定M:Marker;1:EcoRⅠ和BamHⅠ酶切;2:XbaⅠ和BamHⅠ酶切;3:SalⅠ和BamHⅠ酶切;4:M luⅠ和BamHⅠ酶切。

2.2 CM V-EGFP片段擴(kuò)增結(jié)果 以 pEGFP-C3為模板,PCR擴(kuò)增出了帶SalⅠ和M luⅠ接頭的CMV-EGFP片段,電泳顯示條帶大小與預(yù)期一致。見圖2。

圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果M:Marker;1:PCR產(chǎn)物。

2.3 pLKO-1-EGFP-puro的鑒定 連接體系轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH5α約長出 10個菌落,提取菌落質(zhì)粒,用SalⅠ和M luⅠ雙酶切后電泳可見 1.6 kb片段,表明 pLKO-1-EGFP-puro構(gòu)建成功。見圖3。

3 重組慢病毒載體質(zhì)粒 pLKO-1-EGFP-puro的鑒定1:pLKO-1-EGFP-puro雙酶切產(chǎn)物;M:Marker。

2.4 病毒感染效率 不同稀釋度的病毒濃縮液感染 Vero細(xì)胞 48 h后,在倒置熒光顯微鏡下可見 96孔板內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光。以 103稀釋度和 106稀釋度為例,后者較前者熒光強(qiáng)度明顯降低,見圖4。

圖4 重組慢病毒載體感染 Vero細(xì)胞 48h后 GFP的表達(dá) (×200)A:103稀釋度病毒感染孔的熒光表達(dá);B:106稀釋度病毒感染孔的熒光表達(dá)。

3 討論

慢病毒載體最大的特點就是強(qiáng)大的穿透性[4],并能感染非分裂期細(xì)胞從而實現(xiàn)目的基因穩(wěn)定表達(dá),因此越來越受到神經(jīng)科學(xué)界的重視[5]。

作者采用分子克隆的方法成功構(gòu)建了一種新型的慢病毒載體質(zhì)粒 pLKO-1-EGFP-puro,并利用 3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方法產(chǎn)生了完整的慢病毒載體。該載體與以往報道的慢病毒載體相比有兩大優(yōu)勢。首先,作者改建的 pLKO-1-EGFP-puro載體既含有 GFP報告基因,又含有 puro抗性基因,具有很強(qiáng)的實用性,GFP報告基因基因以 CMV啟動子啟動,其表達(dá)效率高,能達(dá)到 95%以上,觀察結(jié)果方便快捷;puro抗性基因的啟動序列為 hPGK,同樣也具有很高的啟動效率,可在不依賴儀器設(shè)備的條件下對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行篩選。這與文獻(xiàn) [6]報道相一致。其次,作者改建的MCS的酶切位點包括AgeⅠ、EcoRⅠ、XbaⅠ、SalⅠ與M luⅠ,可以與多種入門載體 psi-hU6、psi-H1及 psi-mU6等兼容,尤其是在構(gòu)建 siRNA載體時,可以直接由相關(guān)網(wǎng)站工具相互對接,減少設(shè)計與操作上的麻煩與失誤,同時由于存在 4個酶切位點,可以連接 3個不同的 siRNA序列針對同一個基因進(jìn)行調(diào)控,也可以針對 3個不同基因同時進(jìn)行調(diào)控,極大地提高了應(yīng)用范圍與工作效率。

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(2009-05-17收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Construction of a noval lentiviral vector pLK O-1-EGFP-puro

SONG B o,HAN Zhiqiang,WU Shaopu,L IU Jingwei,CA I Xiaohui,YANG Jing,XU Yum ing
Departm ent of Neurology,the First Affiliated Hospital,Zhengzhou University,Zhengzhou 450052

neurological genetic disease;lentiviral vector;green fluorescent protein;puromycin resistance

A im:To construct lentiviral vector with green fluorescent protein(GFP)and puromycin(puro)-resistant gene.Methods:Themultiple clone site(MCS)of lentiviralplasmid pLKO-1-puro was reconstructed to be more compatible,and CMV-EGFP was also amplified from plas mid pEGFP-C3 by PCR.After double digestion,the new pLKO-1-puro and CMV-EGFP sequences were ligated to form another lentiviral plas mid pLKO-1-EGFP-puro,which was cotransfected into 293T cellswith packaging plasmidΔ8.2 and envelop plasmid VSV-G to produce recombined lentivirus particles.Finally,the GFP expression was assayed by lentivirus infected Vero cells.Results:The MCS of pLKO-1-puro was successfully reconstructed.The new pLKO-1-puro was also inserted correctly by CMV-EGFP to form recombined pLKO-1-EGFP-puro.Lentiviral particles produced by cotransfection of three plasmids into 293T cells had high GFP expression in Vero cells.Conclusion:Recombinant lentiviral vectorwith GFP gene and puro resistance has been successfully constructed.

R741.05

＊河南省教育廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃基金資助項目 2007310016