HPLC法測定人血漿中來曲唑濃度及人體相對生物利用度

趙玉婷 徐世希 王勝峰 周彥彬 田 娟 冉黎靈 左 英 丁勁松*

中南大學藥學院（410013）

來曲唑是人工合成的第3代非甾體類高選擇性芳香化酶抑制劑[1]，通過與細胞色素P450芳香化酶中亞鐵血紅素的鐵原子結合，競爭其活性位點并抑制該酶活性，從而減少雌激素的生物合成[2]。臨床上主要用于雌激素依賴性疾病，如婦女絕經期乳腺癌[3]和不孕癥[4]的治療。目前，生物介質中來曲唑的測定方法有高效液相色譜法（highperformance liquid chromatography，HPLC）[5,6]、酶免疫分析法[7]和高效液相-串聯質譜法[8]等。酶免疫分析法在分析過程中會生成很多交聯反應代謝物影響其準確性和重現性；高效液相-串聯質譜儀器普及難度大，不適于多數實驗室采用；HPLC法具有準確度高、重現性好、成本較低等優點，是檢測來曲唑濃度的常用方法。本實驗成功建立了測定人體血漿樣品中來曲唑濃度的HPLC-UV法，并通過比較分析來曲唑分散片和來曲唑片在健康受試者體內的藥動學特征，評價其相對生物利用度及二者的生物等效性，從而為來曲唑分散片的臨床合理用藥提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津LC-2010C高效液相色譜儀；LC-Solution數據處理系統；TGL16M臺式高速冷凍離心機（長沙英泰儀器有限公司） ；AB-265S型分析天平（日本梅特勒）；WH-2微量旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

來曲唑對照品（北京德眾萬全藥物技術開發有限公司提供，批號：070322，含量：99.75%）；咪唑斯汀對照品（三九醫藥股份有限公司提供，批號：20070307，含量：99.6%）；磷酸二氫鉀（廣東汕頭市西隴化工廠，批號：060612），乙腈（色譜純，TEDIA）；其他試劑均為國產分析純（AR級）；所有試驗用水均為超純水。

1.2 貯備液的配制

來曲唑貯備液：精密稱取來曲唑對照品0.04977g（相當于來曲唑0.04965g）于50mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度（0.9929mg/mL）。置于-4℃冰箱中保存，使用時稀釋至所需濃度。

內標貯備液：精密稱取咪唑斯汀對照品0.01002g于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度（0.20mg/mL）。置于-4℃冰箱中保存，使用時稀釋至所需濃度（1.0μg/mL）。

1.3 色譜條件

色譜柱：迪馬 Diamonsil C18柱（4.6mm×200mm，5μm）；柱溫：30℃；流動相：乙腈∶磷酸二氫鉀溶液＝41∶59（v/v）；流速：1.0mL/min；檢測波長：239nm。

1.4 血漿樣品處理

精密吸取血漿1.0mL，置10mL具塞尖底玻璃離心管中，加入內標溶液（1.0μg/mL咪唑斯汀溶液）100μL，渦漩混勻，加入4mL乙醚，渦旋3min，2000r/min離心5min，轉移有機相至另一支干燥的10mL具塞尖底玻璃離心管中，40℃水浴氮氣吹干，殘渣用流動相100μL復溶，進樣20μL。

1.5 給藥與血樣采集

本試驗經中南大學藥學院倫理委員會批準。18名健康男性受試者，年齡為19～24歲，體質量61～72kg，在簽署知情同意書并體檢合格后納入試驗。受試者隨機分成兩組，禁食12h后，于次日晨分別空腹口服來曲唑分散片或來曲唑片2.5mg，在給藥前（0h）和給藥后0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2、4、8、12、24、48、96、144h 從肘靜脈取血5mL，3周后交叉服藥，取血方法和時間點同前1周期。采集的血樣標本置于肝素化試管中，立即離心分離血漿，-20℃保存至測定。

1.6 藥物動力學參數的計算和統計學處理

參數Tmax和Cmax為實測值，AUC0-t用梯形面積法計算，消除速率常數K和t1/2用血藥濃度-時間曲線尾端（消除相）數據直線回歸計算。AUC0-t、Cmax經對數轉換后進行藥物間、周期間、個體間的3個因素方差分析，再以雙向單側t檢驗進行生物等效性評價，Tmax進行非參數檢驗。

2 結 果

2.1 色譜行為

在選定的色譜條件下，來曲唑與內標及血漿中內源性雜質分離良好，來曲唑和內標的保留時間分別為6.8和8.0min，峰形良好。空白血漿、來曲唑和內標對照品、空白血漿中加入來曲唑和內標對照品、受試者服藥后血漿樣品的色譜圖見圖1。

圖1 空白血漿（A）、來曲唑（1，2000μg/L）和內標（2）對照品（B）、來曲唑（49.6μg/L）和內標加入空白血漿基質中（C）和受試者口服受試制劑1.5h后的血漿樣本加入內標后色譜圖（36.36μg/L）（D）

2.2 線性范圍和定量下限

精密吸取空白血漿1.0mL，置10mL具塞尖底玻璃離心管中，分別加入來曲唑貯備液，配制成來曲唑濃度為2.48、3.10、6.20、12.40、24.80、49.60、99.20μg/L的標準血漿樣品，渦旋1min，混勻，按“血漿樣品處理”項操作，記錄色譜圖。以測得的來曲唑峰面積A與內標峰面積Ai比值對來曲唑血藥濃度C（μg/L）進行線性回歸，得回歸方程為A/Ai＝0.0570×C+0.0925 （r=0.9994）。血漿中來曲唑濃度在2.48～99.2μg/L范圍內與峰面積比線性關系良好，其最低定量濃度為2.48μg/L。

2.3 萃取回收率

配制濃度為2.48、6.20、12.40、49.6μg/L的來曲唑無水乙醇液和1.0μg//mL的咪唑斯汀甲醇液，每個濃度各制備5份作為對照品溶液，取20μL進樣記錄色譜圖，得到對照溶液中來曲唑和內標的峰面積。另用空白血漿配制成來曲唑濃度為2.48、6.20、12.40、49.60μg/L和內標濃度為1.0μg/mL的血漿樣品各5份。按“1.4”項下處理，進樣20μL記錄血漿樣品中來曲唑和內標的峰面積，以血漿樣品的峰面積除以同濃度的對照品峰面積所得的百分率計算萃取回收率。結果來曲唑4個濃度的萃取回收率分別為（90.55±12.26）%、（88.38±1.62）%、（88.82±8.65）%、（67.56±10.46）%（n=5）；內標萃取回收率為（81.42±6.38）%（n=5）。

2.4 方法回收率及精密度

配制來曲唑濃度為2.48、6.20、12.40、49.60μg/L的血漿樣品各5份，按“1.4”項下處理后進樣，記錄來曲唑和內標峰面積，按回歸方程計算測得濃度，分別在1天內測定5次，以測得值與加入值的比值計算方法回收率和日內精密度。上述3組樣品連續測定3d，計算日間精密度。結果方法回收率在87.88%～104.02%（n=20），日內、日間RSD均＜10%。

2.5 樣品穩定性試驗

配制來曲唑濃度為6.20、12.40、49.60μg/L的血漿樣品，室溫下放置8h、復溶后室溫下放置12h、反復凍融2次或凍存20d，檢驗其穩定性。結果在這4種情形下，來曲唑血漿樣品均處于穩定狀態（RSD＜8.6%）。

2.6 方法學質控

配制來曲唑濃度為6.20、12.40、49.60μg/L的血漿樣品，即質控樣品（QC樣品），按“1.4”項下操作，20μL進樣。低、中、高3個濃度的質控樣品均勻分布在未知樣品測試順序中。本試驗進行了9次共27個QC樣品，結果QC樣品的測定值均落在靶值的87.7%～113.04%。

2.7 血樣測定和藥物動力學參數

18例受試者口服來曲唑受試制劑或參比制劑后的0～144h平均血藥濃度-時間曲線見圖2，受試試劑和參比制劑的主要藥代動力學參數見表1。

圖2 18例男性健康志愿者單劑量口服受試制劑（T）或參比制劑（R）2.5 mg后平均血藥濃度-時間曲線

2.8 統計檢驗結果

用梯形法（AUC0-t）估算受試制劑與參比制劑的相對生物利用度為（101.20±19.33）%。方差分析結果表明，二者主要藥動學參數Cmax、AUC0-144和AUC0-∞在制劑間和周期間均沒有顯著性差異（P＞0.05）；Cmax、AUC0-144、AUC0-∞比值的90%置信區間分別為95.1%～103.3%、90.5%～108.4%、84.7%～112.1%；兩制劑的Tmax經非參數法檢驗未發現有顯著性差異（P＞0.05），根據以上結果判定兩制劑生物等效。

表1 18名健康受試者分別單劑量口服2.5mg來曲唑受試制劑或參比制劑后的藥物動力學參數（n=18，±SD）

表1 18名健康受試者分別單劑量口服2.5mg來曲唑受試制劑或參比制劑后的藥物動力學參數（n=18，±SD）

參數 來曲唑分散片（T） 來曲唑片（R）AUC0-144 [μg/(h·L)] 1662.65±300.94 1682.69±329.26 AUC0-∞ [μg/(h·L)] 2014.94±580.66 2063.84±571.17 Cmax (μg/L) 33.20±4.25 33.60±5.17 Tmax (h) 1.60±0.65 1.50±0.34 t1/2 (h) 70.61±21.21 66.82±18.26 F (%) 101.20±19.33

3 討 論

本文建立的測定來曲唑濃度的HPLC-UV法具有成本低、速度快、操作簡便、敏感度高及準確性好等優點。文獻采用C18柱液-固相萃取方法[9]，回收率提高，但成本增加，洗脫時間長（大約20min）；本文以乙醚為萃取劑，操作簡單、成本降低，萃取回收率高，保留時間僅為6.8min，耗時少。此方法的定量下限為2.48μg/L，方法回收率在87.88%～104.02%（n=20），日內、日間RSD均＜10%，符合體內藥物分析及藥動學研究的要求。此外，本實驗首次采用咪唑斯汀為內標，其色譜峰與來曲唑及內源性物質完全分離，保留時間為8min，穩定性好，符合內標選擇的標準。

兩種制劑的藥動學參數統計分析結果表明，來曲唑分散片的相對生物利用度為（101.20±19.33）%。兩制劑Cmax、AUC0-144和AUC0-∞沒有顯著性差異（P＞0.05），其比值的90%置信區間均符合生物制劑等效標準，Tmax經非參數法檢驗亦未發現顯著性差異（P＞0.05），表明來曲唑分散片和來曲唑片具有生物等效性。

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