活血抗生滴丸對(duì)AA大鼠的抗炎與免疫調(diào)節(jié)作用

張文亮 王淑美* 陳 剛

大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant -induced arthritis，AA）屬免疫性炎癥模型，可表現(xiàn)為免疫功能紊亂、細(xì)胞因子失調(diào)及體內(nèi)相關(guān)激素水平異常等，其組織學(xué)特點(diǎn)包括滑膜增生，單核細(xì)胞浸潤(rùn)、關(guān)節(jié)軟骨及骨組織破壞，與人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）很近似[1]。活血化瘀中藥治療RA有較好療效[2]。本試驗(yàn)探討了具有活血化瘀功效的活血抗生滴丸（Huoxuekangsheng Dripping Pills，HXKSDP）對(duì)AA模型大鼠炎癥發(fā)展和免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)Wistar大鼠50只，雄性，體質(zhì)量180～220g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXKa（渝）20020003。

1.1.2 藥物

HXKSDP由川芎、當(dāng)歸、延胡索等藥物組成。所有中藥飲片購(gòu)自重慶桐君閣大藥房，經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定為正品。中藥飲片用乙醇滲漉法提取，工藝條件為12倍量，75%乙醇滲漉，滲漉速度為3mL/min，選用D101型大孔樹(shù)脂純化提取物，用1倍量的樹(shù)脂吸附，5倍量的60%乙醇洗脫，減壓濃縮成含生藥量10g/mL的浸膏，將浸膏加入溶化的PEG-4000，保持溫度98～100℃，滴制成滴丸，包薄膜衣。每克滴丸含阿魏酸不低于3mg。規(guī)格：每丸30mg。

環(huán)孢素A（cyclosporine A，CsA）由四川抗菌素工業(yè)研究所提供，批號(hào)：021102。

1.1.3 試劑

弗氏完全佐劑（FCA，1mg/mL高溫干燥滅活的結(jié)核桿菌），為Sigma公司產(chǎn)品。免疫球蛋白IgG、IgM、IgA 檢測(cè)用試劑（北京東亞免疫技術(shù)研究所），F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗鼠CD4+單抗、PE標(biāo)記的抗鼠CD8+單抗（晶美生物工程有限公司），流式細(xì)胞儀（FACS CALIBUR，美國(guó)BD公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模與分組

無(wú)菌條件下于大鼠左后足掌皮下注射FCA 0.1mL。成模率100%。動(dòng)物免疫后第19天，Wistar大鼠隨機(jī)分為5組，即HXKSDP生藥含量0.63、1.25、2.5g/(kg?d)劑量組、陽(yáng)性對(duì)照CsA10mg/(kg?d)組及模型組給予生理鹽水2mL/d，每組10只，1次/d，連續(xù)灌胃30d。

1.2.2 對(duì)AA大鼠踝關(guān)節(jié)炎癥的影響

采用Volume meter測(cè)定大鼠雙側(cè)踝關(guān)節(jié)以下足容積之和，從開(kāi)始灌胃給藥起，每10d量取，與造模前足容積之差值為腫脹度（mL）[3]。灌胃30d后取完整踝關(guān)節(jié)切片，HE染色后觀察大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織的改變。

1.2.3 對(duì)AA大鼠免疫功能的影響

灌胃后第30天，股動(dòng)脈取血。處死動(dòng)物后，稱取各組動(dòng)物脾、胸腺重量，并計(jì)算其臟器指數(shù)[4]。器官指數(shù)=器官濕重/大鼠體質(zhì)量×100。免疫單擴(kuò)散法測(cè)定外周血中IgG、IgM、IgA含量。流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+及CD4+/ CD8+比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié) 果

2.1 HXKSDP對(duì)大鼠AA的抗炎作用

治療20、30d后，HXKSDP高劑量組和CsA組足腫脹度降低，與模型組比較差異有顯著性（P＜0.01），見(jiàn)表1。

HE染色可見(jiàn)模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜增生，滑膜細(xì)胞數(shù)量增多，體積增大，排列為多層；滑膜下組織水腫、充血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。HXKSDP高劑量組和CsA組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織增生明顯減少，炎性反應(yīng)減輕。

2.2 HXKSDP對(duì)AA大鼠免疫功能的影響

給藥30d后，HXKSDP高劑量組和CsA組AA大鼠的免疫器官脾和胸腺指數(shù)明顯降低，與模型組比較差異有顯著性（P＜0.01），見(jiàn)表2。

給藥30d后，HXKSDP高劑量組和CsA組能夠有效地降低血清中IgG 水平，減少CD4+細(xì)胞數(shù)，升高CD8+細(xì)胞數(shù)，降低CD4+/ CD8+比值（P＜0.01）。結(jié)果提示HXKSDP對(duì)AA大鼠體液免疫及細(xì)胞免疫均有一定抑制作用，見(jiàn)表3和4。

3 討 論

大鼠AA模型是一種免疫性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。炎癥以踝關(guān)節(jié)為重，可侵及足墊、全足，病理改變?yōu)榛は陆M織炎癥，滑膜增生，血管翳形成和軟骨破壞。Ts細(xì)胞功能和單核巨噬細(xì)胞異常活化在發(fā)病中占重要地位，從組織學(xué)而言，滑膜炎癥的發(fā)展是以巨噬細(xì)胞核CD4+T細(xì)胞占主要地位。且AA大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)及血液中的變化與人類RA極其相似。

RA是一種自身免疫性疾病，存在著體液免疫與細(xì)胞免疫功能的失調(diào)。體液免疫方面，B細(xì)胞功能亢進(jìn)，致使免疫球蛋白分泌失控，大量分泌的免疫球蛋白與相應(yīng)抗原結(jié)合，存在于血液循環(huán)中或沉積于關(guān)節(jié)滑膜等處，致IgA、IgM，IgG升高。細(xì)胞免疫方面，CD4+升高，CD4+/ CD8+比值升高在RA的病理機(jī)制中起重要作用[4,5]。

表1 HXKSDP對(duì)AA大鼠足腫脹度的影響（±s，n=10）

表1 HXKSDP對(duì)AA大鼠足腫脹度的影響（±s，n=10）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

腫脹度(mL)治療前 治療10d 治療20d 治療30d模型組 —— 1.80±0.26 1.77±0.23 1.74±0.31 1.76±0.29 CsA組 10mg/(kg?d)1.79±0.27 1.41±0.27* 1.13±0.22** 1.04±0.18**HXKSDP低劑量 0.63g/(kg?d)1.78±0.19 1.69±0.34 1.66±0.24 1.65±0.31 HXKSDP中劑量 1.25g/(kg?d)1.83±0.28 1.71±0.30 1.46±0.25* 1.39±0.28*HXKSDP高劑量 2.5g/(kg?d)1.82±0.21 1.44±0.31* 1.25±0.19** 1.11±0.23**

表2 HXKSDP對(duì)AA大鼠免疫器官的影響（±s，n=10）

表2 HXKSDP對(duì)AA大鼠免疫器官的影響（±s，n=10）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

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表3 HXKSDP對(duì)AA大鼠體液免疫的影響（±s，n=10）

表3 HXKSDP對(duì)AA大鼠體液免疫的影響（±s，n=10）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

組 別 劑量 IgG IgA IgM模型組 —— 26.74±5.16 3.21±0.54 1.93±0.60 CsA組 10mg/(kg?d)13.56±3.68** 2.62±0.56* 1.69±0.49 HXKSDP低劑量 0.63g/(kg?d)22.31±4.76 3.24±0.59 1.90±0.35 HXKSDP中劑量 1.25g/(kg?d)18.13±3.75* 2.73±0.61 1.86±0.42 HXKSDP高劑量 2.5g/(kg?d)15.18±3.41** 2.77±0.60 1.89±0.59

表4 HXKSDP對(duì)AA大鼠T淋巴細(xì)胞的影響（±s，n=10）

表4 HXKSDP對(duì)AA大鼠T淋巴細(xì)胞的影響（±s，n=10）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

組 別 劑量 CD4+(%)CD8+(%)CD4+ / CD8+模型組 —— 48.70±6.06 20.38±4.25 2.41±0.31 CsA組 10mg/(kg?d)38.56±5.23** 23.81±4.14** 1.65±0.26**HXKSDP低劑量 0.63g/(kg?d)47.25±5.33 20.78±4.84 2.28±0.40 HXKSDP中劑量 1.25g/(kg?d)45.74±6.20 22.23±2.58 2.04±0.31*HXKSDP高劑量 2.5g/(kg?d)42.33±4.52** 24.07±4.20** 1.73±0.21**

RA屬于中醫(yī)“頑痹”、“骨痹”、“歷節(jié)病”、“白虎病”、“痹”等范疇，風(fēng)、寒、濕、熱等邪氣雜至襲于經(jīng)絡(luò)、痹于關(guān)節(jié)，使氣血運(yùn)行不暢，晚期引起關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形。《雜病源流犀濁?諸痹源流》謂：“痹者，閉也，三氣雜至，壅痹經(jīng)絡(luò)，血?dú)獠恍校荒茈S時(shí)祛散，故久為痹”。可見(jiàn)RA 與“血瘀”關(guān)系密切。RA存在微循環(huán)障礙和血液流變學(xué)異常，并有隨著病程的延長(zhǎng)而有逐漸加重的傾向。“血瘀”在RA中的重要性決定了活血化瘀是RA的一個(gè)基本治則。葉天士提出痹久不愈，邪入于絡(luò)，用活血化瘀法治療。臨床上活血化瘀方藥如桃紅飲、桃紅四物湯、血府逐瘀湯、復(fù)方丹參注射液等在RA的治療中已廣泛應(yīng)用并顯示出確切的療效。本實(shí)驗(yàn)研究的HXKSDP由川芎、當(dāng)歸、延胡索等中藥提取精制組成。其中川芎為血中之氣藥，兼有祛風(fēng)通絡(luò)之功；當(dāng)歸養(yǎng)血活血，使祛瘀而不傷正；延胡索活血行氣止痛。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HXKSDP能明顯減輕AA大鼠的關(guān)節(jié)腫脹，減輕炎癥關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞，降低免疫器官脾指數(shù)、胸腺指數(shù)，能明顯降低IgG含量，減少CD4+細(xì)胞數(shù)，升高CD8+細(xì)胞數(shù)，降低CD4+/ CD8+的比值。可見(jiàn)該藥對(duì)AA大鼠具有明顯的抗炎和免疫抑制作用，這可能也是活血化瘀中藥治療RA的機(jī)制之一。

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