腰腿理痛散對(duì)自體髓核移植硬膜外大鼠神經(jīng)根損傷的保護(hù)作用

聶存平，張思勝，王臨青，潘建西，談明順

（1.蘭州中醫(yī)骨傷科醫(yī)院，甘肅蘭州 730010；2.蘭州市西固區(qū)中醫(yī)院，甘肅蘭州 730060）

腰腿理痛散對(duì)自體髓核移植硬膜外大鼠神經(jīng)根損傷的保護(hù)作用

聶存平1，張思勝1，王臨青1，潘建西1，談明順2

（1.蘭州中醫(yī)骨傷科醫(yī)院，甘肅蘭州 730010；2.蘭州市西固區(qū)中醫(yī)院，甘肅蘭州 730060）

目的觀察腰腿理痛散對(duì)自體髓核移植硬膜外大鼠神經(jīng)根損傷的保護(hù)作用。方法取成年健康、Wistar大鼠50只，將其隨機(jī)分為假手術(shù)組（A組）、模型組（B組）、對(duì)照組（C組、腰痛寧組）、腰腿理痛散高劑量組（D組）、腰腿理痛散低劑量組（E組），每組10只，將大鼠自身的尾椎髓核取出移植于其左側(cè)硬膜外腔L5、L6神經(jīng)根背側(cè)，造成非壓迫性大鼠自體髓核移植硬膜外模型，觀察2周時(shí)大鼠神經(jīng)根的組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果B、C、D、E組大鼠神經(jīng)根均產(chǎn)生明顯可見的組織形態(tài)學(xué)改變，但C、D、E組大鼠的改變程度較B組輕。結(jié)論腰腿理痛散有減輕非壓迫性髓核損傷神經(jīng)根所導(dǎo)致的組織形態(tài)病理學(xué)改變，改善或抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)根的作用。

腰腿理痛散；自體髓核；神經(jīng)根；組織學(xué)

腰椎間盤髓核突出是導(dǎo)致根性神經(jīng)痛常見的原因，傳統(tǒng)的髓核突出機(jī)械壓迫并不能滿意地解釋與髓核相關(guān)的所有現(xiàn)象，髓核的生物化學(xué)和（或）免疫反應(yīng)作用損傷神經(jīng)根和根性神經(jīng)痛有密切的關(guān)系。腰腿理痛散是根據(jù)全國知名中醫(yī)骨傷科專家郭憲章治療腰椎間盤突出癥（Protrusion of the lumbar intervertebral disc，PLID）的經(jīng)驗(yàn)方經(jīng)劑型改良而制成的純中藥制劑，具與其他有補(bǔ)益肝腎、理氣通經(jīng)、活血止痛等作用，經(jīng)長期臨床實(shí)踐證明，對(duì)其PLID有著較好的療效。為了揭示該藥的作用機(jī)制，本研究將大鼠的自體髓核組織移植到腰椎硬膜外腔，建立非壓迫性大鼠自體髓核移植硬膜外模型，觀察其對(duì)髓核損傷神經(jīng)根后的組織形態(tài)學(xué)變化。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年健康、Wistar大鼠50只，體重250～300 g，由甘肅省藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

1.2.1 腰腿理痛散由淫羊藿、炒杜仲、金毛狗脊、川牛膝、芡實(shí)、薏仁、白術(shù)、小茴香、臺(tái)烏藥、青皮、香附、升麻、當(dāng)歸、赤芍、桃仁、紅花、丹參、三七、甘草等藥物組成。劑型：膠囊。規(guī)格：40克/瓶，生藥0.2克/粒。用法用量：每次10粒，每日2次，口服，1周為一療程。

1.2.2 腰痛寧膠囊規(guī)格：0.3克/粒，由河北省承德中藥廠生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：冀衛(wèi)藥準(zhǔn)字（1995）第080197號(hào)。用法用量：每次5粒，每日1次，口服，30天為一療程。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

將50只大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分為假手術(shù)組（A組）、模型組（B組）、對(duì)照組（C組、腰痛寧組）、腰腿理痛散高劑量組（D組）、腰腿理痛散低劑量組（E組）。

2.2 模型制備

大鼠稱重后，用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，于尾根部距肛門約1 cm處切斷鼠尾并縫合傷口。在切斷鼠尾前，用橡皮條結(jié)扎切口的近端以減少出血。在無菌條件下，于背部正中切開皮膚（長約2 cm）、皮下組織，從左側(cè)棘突上鈍性分離椎旁肌，切除L5～L6的棘突、左側(cè)椎板和關(guān)節(jié)突，在手術(shù)顯微鏡下暴露左側(cè)的硬脊膜，確認(rèn)左側(cè)的L5、L6神經(jīng)根，取前切自鼠尾部的呈膠凍樣椎間盤髓核5個(gè)（約10 mg），輕放于左側(cè)L5、L6神經(jīng)根背側(cè)周圍，注意不能造成機(jī)械性壓迫，由于髓核組織具有很強(qiáng)的黏性，無需特別固定，應(yīng)逐層縫合傷口，假手術(shù)組（A組）僅切斷鼠尾并縫合傷口。術(shù)后3天內(nèi)，各組大鼠均腹腔注射青霉素鈉40萬U，每天1次，以預(yù)防感染。

2.3 給藥及給藥途徑

術(shù)后第二天開始給大鼠灌胃給藥，每日1次，連續(xù)2周。按人/大鼠體表面積換算等效劑量法計(jì)算后，對(duì)照組（C組）用腰痛寧膠囊灌胃，劑量為10 ml/kg（0.15 g/kg）；腰腿理痛散高、低劑量組（D組、E組）用腰腿理痛散灌胃，劑量為10ml/kg（高劑量組含生藥0.8 g/kg、低劑量組含生藥0.4 g/kg）；假手術(shù)組（A組）、模型組（B組）用0.9%生理鹽水注射液10ml/kg灌胃。

2.4 取材和組織形態(tài)學(xué)觀察

所有大鼠造模后第十五天用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，于仰臥位固定，打開胸腔，在主動(dòng)脈近心處置線，剪開左心室置管入主動(dòng)脈升部，結(jié)扎固定后剪開右心耳，用0.1 mol/L PBS緩沖液（pH=7.4）400 ml灌洗，繼而用4%多聚甲醛-0.1 mol/L PBS緩沖液（pH=7.4）400 ml灌注固定30 min后取左側(cè)L5、L6神經(jīng)根。將取出的神經(jīng)根組織在4%多聚甲醛-0.1 mol/L PBS緩沖液（pH=7.4）中于室溫下固定4 h，脫水后用石蠟包埋，常規(guī)切片（片厚3 μm），切片脫蠟至水，HE染色，常規(guī)脫水、透明、樹膠封片，觀察其神經(jīng)根組織形態(tài)學(xué)變化[1]。

3 結(jié)果

（1）A組神經(jīng)根神經(jīng)纖維排列規(guī)律，大小基本一致，髓鞘圓形位于周圍、呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，軸突位于中央（見圖1）。

（2）B組神經(jīng)根軸突部分或完全消失，髓鞘腫脹或崩解消失，遺留壞死輪廓（見圖2）。

（3）C組神經(jīng)根神經(jīng)纖維大小不等，水腫變粗，軸突部分消失，髓鞘腫脹，部分有脫髓鞘改變（見圖3）。

（4）D組神經(jīng)根神經(jīng)纖維水腫變粗，大小不一，髓鞘腫脹，少量軸突消失（見圖4）。

（5）E組神經(jīng)根神經(jīng)纖維粗細(xì)不等，髓鞘腫脹，軸突少量消失（見圖5）。

4 討論

PLID是導(dǎo)致根性腰腿痛的常見原因。突出的椎間盤髓核對(duì)神經(jīng)根的機(jī)械性壓迫并不是引起患者根性神經(jīng)痛與功能障礙的惟一原因。例如：（1）經(jīng)CT或MRI證實(shí)某些PLID患者的神經(jīng)根受壓并不嚴(yán)重，而疼痛卻表現(xiàn)十分劇烈；另一些患者的神經(jīng)根受壓嚴(yán)重，而疼痛卻相對(duì)較輕。臨床的研究結(jié)果表明，PLID患者的神經(jīng)根受壓程度與其臨床癥狀和疼痛程度并無直接關(guān)系。（2）通過保守治療，雖然突出的髓核并未改變，但臨床癥狀可以獲得改善甚至消失不再發(fā)作。（3）手術(shù)摘除壓迫神經(jīng)根的突出髓核，部分患者的疼痛癥狀改善不明顯，甚至反而加重。近年來椎間盤源性根性神經(jīng)痛機(jī)理的臨床和基礎(chǔ)研究結(jié)果表明，髓核導(dǎo)致的炎性反應(yīng)對(duì)神經(jīng)根的損傷在PLID的發(fā)病中起著重要作用。

圖1 A組神經(jīng)根（HE×400）

圖2 B組神經(jīng)根（HE×400）

圖3 C組神經(jīng)根（HE×400）

圖4 D組神經(jīng)根（HE×400）

圖5 E組神經(jīng)根（HE×400）

目前對(duì)于髓核組織致炎作用的機(jī)理，主要有2種：（1）生物化學(xué)刺激作用引起炎癥。（2）髓核組織具有的自體免疫原性導(dǎo)致炎癥。髓核組織中所含有的成分是致炎作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。髓核組織細(xì)胞主要包括軟骨細(xì)胞、纖維細(xì)胞、脊索細(xì)胞、組織細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞等，它們分泌多種物質(zhì)，包括基質(zhì)金屬蛋白酶、磷脂酶A2（PLA2）、一氧化氮（NO）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、前列腺素E2等[2]。在突出的髓核中，上述物質(zhì)均出現(xiàn)了異常改變及有免疫復(fù)合物含量的升高，但它們的具體作用機(jī)理仍不完全清楚。無論是上述哪種機(jī)理，其結(jié)果均表現(xiàn)為無菌性炎癥，而炎癥的出現(xiàn)必然導(dǎo)致神經(jīng)根的損傷。研究炎癥最直接的方法是觀察組織的形態(tài)學(xué)變化。

突出髓核的生物化學(xué)和（或）免疫作用對(duì)脊神經(jīng)根所造成的損傷可導(dǎo)致脊神經(jīng)根組織結(jié)構(gòu)病理學(xué)的改變，表現(xiàn)為炎癥介導(dǎo)的一系列病理過程。Olmarker、Tamaki等觀察到自體髓核移植硬膜外腔刺激3小時(shí)后即可在硬膜外看到白細(xì)胞和肥大細(xì)胞的聚集，硬膜組織充血；脊神經(jīng)根的神經(jīng)纖維損害以有髓纖維為主，可見軸突腫脹，軸漿密度增加，髓鞘碎裂或明顯變薄，雪旺氏細(xì)胞內(nèi)含有髓鞘碎片，其胞漿腫脹明顯，顏色蒼白；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞間質(zhì)水腫，胞漿內(nèi)有輕微空泡樣改變，核膜不清晰，核仁變淡或部分消失。自體髓核移植硬膜外腔刺激7天以后，電鏡檢查可以看到有髓神經(jīng)纖維的雪旺氏細(xì)胞胞漿腫脹，細(xì)胞器增多，富含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基體；一些神經(jīng)纖維可以看到囊泡破裂形成大的空泡；局部施密特-蘭特曼切跡囊性腫脹，單核細(xì)胞浸潤且靠近施密特-蘭特曼切跡[2]。賀石生等[3～4]在大鼠硬膜外移植自體髓核后，在無明顯機(jī)械壓迫的情況下，大鼠出現(xiàn)明顯的痛覺過敏、馬尾神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢及神經(jīng)根組織形態(tài)學(xué)的改變，光鏡下可見有明顯的神經(jīng)內(nèi)膜間隙水腫、充血，神經(jīng)纖維有崩解及脫髓鞘改變；電鏡下可見神經(jīng)膜細(xì)胞核固縮，胞質(zhì)腫脹，細(xì)胞器消失，胞膜斷裂，髓鞘板層狀結(jié)構(gòu)崩解，軸突密度不均，軸突旁可見多形核巨噬細(xì)胞出現(xiàn)，而對(duì)照組無此改變。

在臨床上我們觀察到，急性PLID患者在臥床休息一個(gè)月左右腰腿痛可自行緩解或消失。陸志東等[5]將大鼠自體尾椎髓核混懸液注射到腰椎硬膜外腔，觀察到3～20 d神經(jīng)根有明顯的組織形態(tài)學(xué)改變，30 d左右神經(jīng)根組織形態(tài)學(xué)改變基本恢復(fù)正常，說明在PLID的發(fā)病過程中臨床癥狀的發(fā)展變化過程與突出髓核對(duì)神經(jīng)根的損傷所導(dǎo)致的組織形態(tài)學(xué)變化趨勢(shì)是基本一致的。所以本研究在將大鼠的自體尾椎髓核移植于L5、L6神經(jīng)根背側(cè)周圍后2周，這一神經(jīng)根表現(xiàn)較為明顯的時(shí)間取材。實(shí)驗(yàn)顯示，A組大鼠的神經(jīng)根無明顯的組織形態(tài)學(xué)改變，髓核移植各組（B、C、D、E組）大鼠的神經(jīng)根均出現(xiàn)明顯的組織形態(tài)學(xué)改變，說明移植髓核能夠損傷神經(jīng)根，導(dǎo)致其組織結(jié)構(gòu)病理學(xué)的改變。

臨床研究表明，90%以上的PLID可用保守治療來解決[6]。中藥治療以其簡便易行、無毒副作用而成為患者和臨床醫(yī)生的首選。在實(shí)驗(yàn)中觀察到2周時(shí)灌服中藥的3組（C、D、E組）大鼠神經(jīng)根的組織形態(tài)學(xué)改變程度較B組為輕，D、E 2組較C組較輕，說明腰腿理痛散有減輕非機(jī)械壓迫性髓核對(duì)神經(jīng)根損傷后所導(dǎo)致組織形態(tài)病理學(xué)改變，改善或抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)根的作用。這可能與其方中中藥抑制致痛生化炎性因子的釋放和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等作用有關(guān)，需要進(jìn)一步研究探討。

[1]黨雙鎖，劉利兵，洛文田，等.醫(yī)學(xué)常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)精編[M].西安：世界圖書出版西安公司，2004.

[2]張思勝，趙繼榮，趙健雄.非壓迫性髓核致脊神經(jīng)根和脊神經(jīng)節(jié)損傷的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].中國骨傷，2005，18（11）：702～703.

[3]賀石生，侯鐵勝，單曉巍，等.大鼠硬膜外移植自體髓核對(duì)疼痛相關(guān)行為的影響[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，21（1）：74～76.

[4]賀石生，侯鐵勝，單曉巍，等.硬膜外移植自體髓核對(duì)大鼠神經(jīng)根結(jié)構(gòu)和功能的影響[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，22（5）：435～438.

[5]陸志東，金群華，陳志榮.髓核對(duì)大鼠脊神經(jīng)節(jié)非壓迫性損傷的組織形態(tài)學(xué)研究[J].頸腰痛雜志，2004，25（1）：23～25.

[6]趙繼榮，張思勝，聶存平.中國老年骨關(guān)節(jié)病學(xué)[M].蘭州：甘肅文化出版社，2003.

G526.5

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1671-1246（2010）08-0151-03

本文系甘肅省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目（05-GZK-L-01）