降解亞硝酸鹽優勢菌的篩選研究

胡靜榮 (華中科技大學生命科學與技術學院，湖北 武漢 430074)

降解亞硝酸鹽優勢菌的篩選研究

胡靜榮
(華中科技大學生命科學與技術學院，湖北 武漢 430074)

為了篩選出繁殖速度快、降解亞硝酸鹽能力強、經濟成本低的優勢菌種，取不同河流的淤泥樣本分別放入降解亞硝酸鹽的富集培養基中培養、分離、純化。結果篩選出1株降解亞硝酸鹽能力較強的菌，可以在24 h內降解養殖水體容納亞硝酸鹽臨界值的500倍。

亞硝酸鹽；優勢降解菌；篩選

隨著規模化、高密度水產養殖業的迅速發展及工業廢水和生活污水的大量排放，生態環境遭到破壞，嚴重影響了漁業的發展[1]。據報道，養殖水體中容納亞硝酸鹽臨界值為0.2 mg/L，在0.5 mg/L時會引起魚類死亡或患病，高于0.8 mg/L會引起大批死亡；河蟹、對蝦育苗水質的亞硝酸鹽氮應控制在0.1 mg/L以下，在0.3 mg/L時輕度死亡，超過0.5 mg/L將引起大量死亡[2]。為了解決水體亞硝酸鹽含量超標導致魚蝦死亡問題，國內外科研工作者做了大量工作。傳統使用抗生素和其他化學藥物降解亞硝酸鹽的方法不僅收效甚微，而且還引發了一系列環境和社會問題。近年來，人們開始嘗試在養殖水體中使用微生物制劑來改善養殖水體的生態環境，從而降低亞硝酸鹽的含量，如硝化細菌、枯草芽孢桿菌等[3，4]在許多國家已經取得了顯著成效。本研究通過定向篩選、富集培養，以期從淤泥中篩選出繁殖速度快、降解亞硝酸鹽能力強、經濟成本低的優勢菌種，以期為生產工業提供優質材料。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)淤泥樣品 來源于湖北省荊州市古城護城河周邊的污水渠和魚塘。

(2)培養基 亞硝酸鹽液體培養基制作方法：將NaNO20.1 g、NaCl 0.5 g、K2HPO40.5 g、MgSO40.5 g、葡萄糖 0.2 g、鐵鹽母液0.1 mL(亞鐵鹽母液：0.557 g FeSO4，0.745 g EDTA-Na2，加蒸餾水定容至10 mL)加蒸餾水定容至1 L，調pH為7.2，滅菌待用。在液體培養基中加入7 g瓊脂粉，定容至1 L，制成固定培養基，滅菌待用。

1.2 方法

(1)富集培養 將淤泥樣品分別放于裝有100 mL亞硝酸鹽液體培養基中，在37 ℃、170 r/min的恒溫搖床上預備培養，每天檢測預備培養液中亞硝酸鹽的降解情況。從已降解完畢的預備培養液中對應取出1 mL菌液轉入100 mL亞硝酸鹽液體培養基中進行“第一次培養”，48 h后進行檢測。依次類推，進行“第二次培養”、“第三次培養”，共6次培養，使其降解亞硝酸鹽的能力穩定并逐漸純化獲得更多的優勢菌。

本研究采用重氮化偶合法檢測亞硝酸鹽[5，6]，自定義Q表示每次繼代培養48 h，單位體積的菌量降解單位體積培養基中亞硝酸鹽的能力。

式中，DC0表示未接菌培養基的光密度值；DCi表示接菌48 h后培養基的光密度值；M表示接入的菌液量(mL)；N表示培養基的體積(mL)。若P值越大，表示降解能力越強，降解亞硝酸鹽優勢菌純度越高；P值越小，表示降解能力越弱，降解亞硝酸鹽優勢菌純度越低。

(2)菌的純化 取第六次培養后的菌液5 μL，用無菌水稀釋至200 mL后均勻地涂抹在亞硝酸鹽固體培養基平板上，置于37 ℃的恒溫培養箱中24 h，選取生長較大的菌落進行劃線培養，每個菌落2次重復劃平板，置于 37 ℃的恒溫培養箱中24 h。重復中一平板采用重氮化偶合反應法進行染色，觀察顯色反應，若顯示無色表明亞硝酸鹽完全降解，再對應從重復中另一平板上挑選相應菌落進行液體培養，并保存備用。

1.3 數據處理

采用Excel軟件對所得數據進行分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 優勢菌的富集培養

通過富集培養，篩選出2個降解亞硝酸鹽效果理想的混合菌群，分別命名為“一號菌群”和“二號菌群”。從預備培養液中分別取1 mL接入新的培養基進行“第一次培養”，依次類推進行“第二次培養”、“第三次培養”直到“第六次培養”，結果均是“二號菌群”的降解能力強于“一號菌群”，并且隨著繼代培養次數的增加，“二號菌群”的降解能力越強(圖1)。此外，隨著培養次數的增加，2個菌群降解亞硝酸鹽的能力均增強，且經“第五次培養”后降解能力急劇上升。

圖1 菌群的培養次數與降解亞硝酸鹽能力的關系Figure 1 The relationship between subculture times of colonies and the ability of nitrite degradation

從“第六次培養”后的2個菌群中分別取出等體積的菌液進行混合培養，命名為“三號菌群”，目的是研究“一號菌群”與“二號菌群”之間是否存在增效或拮抗作用。結果表明：“二號菌群”效果最好，其次是“三號菌群”，“一號菌群”效果最差，由此說明“一號菌群”與“二號菌群”之間并無增效作用。

2.2 優勢菌的純化

將“三號菌群”涂平板，挑選長勢良好的菌落劃線培養并染色(圖2)，將顯無色的1株菌G置于液體培養基中培養24 h，取5 μL菌液用無菌水稀釋至200 μL后均勻地涂抹在平板上，培養24 h后染色，可見整個平板顯無色，表明菌落純度高、降解亞硝酸鹽能力強(圖3)。

3 討論與小結

目前降解亞硝酸鹽的常見方法有化學法、物理法與微生物分解法3大類。化學方法有氧化還原法，如二氧化氯、高鐵酸鹽等；物理方法有吸附法如沸石粉、活性炭等。但由于所用化學產品(或吸附產品)維持時間短，容易反彈，控制不好且容易污染環境。所以這兩類方法無法解決根本問題。

圖2 菌落劃線培養后顯色圖Figure2 Colonydyeingmapafterstreakculturing圖3 優勢菌繼代培養后顯色圖Figure3 Dyeingmapofpredominantstrainaftersubculture

本研究從淤泥中篩選分離出1株可以在24 h內降解養殖水體容納亞硝酸鹽臨界值的500倍的菌，為生產工業提供了優質菌種材料。

[1]吳 偉.應用復合微生物制劑控制養殖水體水質因子初探[J].湛江海洋大學學報，1997，17(1):17～20.

[2]凌 歌.一種亞硝酸鹽降解新方案及其在水產養殖上的應用[J].漁業致富指南,2010,(12):27.

[3]仇 麗,凌愛珍,祝井愛.枯草芽孢桿菌制劑改良中華絨蟹人工育苗水質的試驗[J].中國水產,2001,(4):82.

[4]韓繼宏,阮宜兵,黃志誠.枯草芽孢桿菌及其在水產養殖中的應用[J].漁業致富指南,2002,(22):52.

[5]Ali A Ensafi，Kazemzadeh A.Monitoring nitrite with optical sensing films[J].Microchemical Journal，2002，72:193～199.

[6]史彩華,王凱華,李志新.水中亞硝酸鹽含量測定[J].安徽農業科學,2008,36 (33):14394 ～14395.

2010-09-15

胡靜榮(1986-)，女，湖北襄樊人，碩士研究生，研究方向為水生態環境保護.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.04.017

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1673-1409(2010)04-S059-03