五田保肝液對酒精性肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究*

宋星星 ，蘇金玲 ，畢業(yè)東 ，于建江 ，范英昌

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，天津 300193；2.天津市漢沽區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 300480）

近年來，中國飲酒人數(shù)增多，尤其是長期、大量飲酒對飲酒者的健康危害巨大，而最嚴(yán)重的是發(fā)展為酒精性肝纖維化、肝硬化。因此，開發(fā)預(yù)防、治療酒精性肝纖維化的藥物具有重要的意義。天津市漢沽區(qū)中醫(yī)醫(yī)院經(jīng)過多年研究，研制的現(xiàn)代中藥制劑“五田保肝液”由田基黃、垂盆草、敗醬草等藥物組成，是針對酒精性肝病（ALD）進(jìn)行治療的方劑，廣泛用于預(yù)防和治療酒精性肝炎、脂肪肝、肝纖維化和肝硬化，具有清熱解毒利濕、活血化瘀的功效，但其發(fā)揮作用的分子機(jī)制仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建大鼠酒精性肝纖維化模型，并檢測血清Ⅲ型前膠原蛋白肽（PⅢP）、層黏連蛋白（LN）等肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)和檢測肝組織轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）mRNA的表達(dá)，探討五田保肝液對酒精性肝纖維化是否有干預(yù)作用以及與TGF-β1的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠100只，雄性，體質(zhì)量180～220 g，由北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供。飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（環(huán)境設(shè)施符合《中華人民共和國衛(wèi)生部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)》二級標(biāo)準(zhǔn)）。

1.1.2 主要試劑 五田保肝液：由深圳市三九現(xiàn)代中藥有限公司提供（由田基黃、垂盆草、敗醬草、丹參、五味子、山楂、草決明、澤瀉、柴胡、生甘草水煎煮，濃縮、干燥、制成單味中藥配方顆粒，以質(zhì)量按6∶6∶4∶4∶3∶3∶3∶2∶2∶1 的比例配成水溶液。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（試行）》（GAP）。易善復(fù)(多烯磷脂酰膽堿膠囊)，由北京賽諾菲安萬特制藥有限公司生產(chǎn)。62°牛欄山二鍋頭，由北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。吡唑，購自上海晶純試劑有限公司。玉米油，購于中糧食品營銷有限公司。大鼠LN及PⅢP酶聯(lián)免疫檢測法（ELISA）試劑盒，購于美國RB公司。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒，購于中生北控生物科技股份有限公司；SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit試劑盒，購于大連寶生物。RNA-Solv Reagent試劑盒，購于美國Omega公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酒精性肝纖維化大鼠模型建立[1]及給藥 100只Wistar雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，分為正常對照組（N組）10只、模型組（M組）、中藥低劑量組（WⅠ組）、中劑量組（WⅡ組）、高劑量組（WⅢ組）、陽性藥易善復(fù)對照組（Y組）各18只。M組、WⅠ組、WⅡ組、WⅢ組、Y組大鼠均以62度牛欄山二鍋頭酒[10mL/（kg·d）]、玉米油[2mL/（kg·d）]、吡唑[25mL/（kg·d）]混合物灌胃，2次/d，早晚各1次。WⅠ組、WⅡ組、WⅢ組大鼠于兩次灌胃之間分別給予五田保肝液0.51 g，1.02 g（成人等劑量），2.04 g/（kg·d）灌胃；Y組和M組大鼠于兩次灌胃之間給予相當(dāng)于成人等劑量的易善復(fù)0.12 g/（kg·d）水溶液和相應(yīng)劑量的生理鹽水灌胃，N組則每日3次以相應(yīng)劑量生理鹽水灌胃。各組大鼠實(shí)驗(yàn)期間均予全價(jià)營養(yǎng)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。造模時(shí)間為12周。

1.2.2 標(biāo)本采集 末次給藥后禁食，隔夜，次日上午處死大鼠，處死前內(nèi)眥靜脈取血，分離血清為ELISA備用；從每只大鼠肝左葉的相同部位取部分組織用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片后，進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）和Masson染色；另從肝右葉的相同部位取小塊組織迅速存于-70℃冰箱，為實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）備用。

1.2.3 檢測指標(biāo)

1.2.3.1 組織病理學(xué)指標(biāo)檢測 常規(guī)HE染色觀察肝臟病理學(xué)改變，Masson染色觀察肝纖維化情況。

1.2.3.2 血清學(xué)指標(biāo)檢測 ELISA法檢測PⅢP、LN，均按試劑盒說明書操作。

1.2.3.3 實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測肝組織TGF-β1表達(dá) 1）采用RNA－Solv Reagent試劑盒提取肝組織（50－100 μg）總 RNA。2）依試劑盒說明書，采用SYBR Prime ScriptTMRT－PCR Kit試劑盒，以 Random 6 mers和 Oligo Dt Primer為引物將總 RNA（500 ng）反轉(zhuǎn)錄為 cDNA（10 μL 體系）。3）以 500 ng的 cDNA產(chǎn)物用作定量PCR擴(kuò)增的模板，采用SYBR Prime－ScriptTMRT-PCR Kit試劑盒和以相應(yīng)基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，看家基因GAPDH為內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用2-△△CT相對定量法分析。

引物設(shè)計(jì)：GAPDH的上游引物為5′-CCCCCA ATGTATCCGTTGTG-3′,下游引物為 5′-TAGCCCA GGATGCCCTTTAGT3′；TGF-β1 的上游引物為 5′-CACCATCCATGACATGAACCG-3′，下游引物為 5′-TTGGTATCCAGGGCTCTCCG-3′。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較均采用單因素方差檢驗(yàn)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠死亡情況 正常組大鼠健康狀況良好，實(shí)驗(yàn)過程中無一只死亡。其他各組大鼠均有死亡，多由乙醇誤入氣管或急慢性乙醇中毒導(dǎo)致。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組剩余大鼠為：正常組10只，模型組8只，五田保肝液低劑量組10只，中劑量組9只，高劑量組10只，陽性藥組9只。

2.2 肝組織病理形態(tài)學(xué)改變

2.2.1 肝組織HE染色結(jié)果HE染色顯示正常組大鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀，無明顯病變。模型組大鼠大量肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴，大量點(diǎn)狀、灶狀壞死伴有炎細(xì)胞浸潤，嗜酸性變多見；五田保肝液各治療組與易善復(fù)治療組肝組織脂肪變性、壞死、嗜酸性變與模型組比較均有不同程度的減少。

2.2.2 肝組織Masson染色結(jié)果正常組大鼠Masson染色顯示僅有少量膠原表達(dá)；模型組大鼠可見匯管區(qū)和中央靜脈周圍有較多的膠原纖維增生，呈放射狀向外延伸，但未相互連接形成間隔，在肝細(xì)胞周圍、肝血竇、狄氏間隙亦有少量膠原表達(dá)；五田保肝液各治療組與易善復(fù)治療組肝組織膠原表達(dá)均有不同程度減少，以五田保肝液中、高劑量組和易善復(fù)組明顯，匯管區(qū)和中央靜脈周圍纖維化少見。

2.3 大鼠血清PⅢP、LN水平 見表1。

表1 五田保肝液對酒精性肝纖維化大鼠血清LN和PⅢP的影響(±sTab.1 Effect of Wutian Baogan solution on LN and PⅢP in rats with of alcoholic liver fibrosis(±sμg/L

表1 五田保肝液對酒精性肝纖維化大鼠血清LN和PⅢP的影響(±sTab.1 Effect of Wutian Baogan solution on LN and PⅢP in rats with of alcoholic liver fibrosis(±sμg/L

注：與N組比較#P＜0.01；與M組比較*P＜0.01。

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模型組大鼠血清LN和PⅢP水平較正常組顯著升高（P<0.01），其他各組大鼠血清LN和PⅢP水平較之模型組降低明顯（P<0.01）。

2.4 大鼠肝組織TGF-β1的表達(dá) 見表2。

表2 五田保肝液對酒精性肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響Tab.2 Effect of Wutian Baogan solution on TGF-β1mRNA expression in rats with alcoholic liver fibrosis

結(jié)果表明：模型組及各治療組TGF-β1的mRNA表達(dá)均高于正常組，差異有顯著性（P＜0.01）；模型組TGF-β1的mRNA表達(dá)高于五田保肝液各劑量組和易善復(fù)組，差異有顯著性（P＜0.01）。

3 討論

中醫(yī)古代文獻(xiàn)對過度飲酒而引起的一系列病證有全面的認(rèn)識(shí)，其中《諸病源候論》所述“酒癖”與酒精性肝纖維化相符，認(rèn)為是過度飲酒，酒、飲停滯于脅肋下，結(jié)聚成癖[2]，因此，在酒精性肝纖維化的治療上不但要清熱利濕解毒，更要注重解散瘀結(jié)。本實(shí)驗(yàn)所用五田保肝液中田基黃清熱利濕，解毒、散瘀、消腫、止痛，垂盆草清熱解毒、利尿消腫共為君藥，以解濕熱酒毒。敗醬草清熱解毒，排膿破瘀、丹參活血祛瘀共為臣藥，助君藥清熱利濕，并能活血化瘀。酸入肝，五味子、山楂味酸能收斂肝陰，山楂亦能活血化瘀，草決明清肝熱、利水，澤瀉利水滲濕、泄熱，共為佐藥。柴胡主入肝經(jīng)，引諸藥入肝經(jīng)，為引經(jīng)藥。《金匱要略》曰：“見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾。”甘草味甘補(bǔ)脾、又能解毒，調(diào)和諸藥，與柴胡共為使藥。總之，五田保肝液作為一種新型的保肝中藥制劑是否具有抗酒精性肝纖維化作用及其作用效果的可能機(jī)制是否與TGF-β1有關(guān)是本實(shí)驗(yàn)研究的目的。

目前肝纖維化具體機(jī)制還不明確，一般認(rèn)為其發(fā)生主要是某些細(xì)胞因子使肝星形細(xì)胞激活，導(dǎo)致包括膠原、非膠原性糖蛋白、蛋白多糖在內(nèi)的肝細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成增多、降解不足，過多的沉積于肝內(nèi)所致[3]。本實(shí)驗(yàn)通過對標(biāo)志性的肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)PⅢP、LN的聯(lián)合檢測從而更全面的反映肝纖維化程度[4]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，五田保肝液各治療組與模型組比較血清PⅢP、LN水平降低明顯（P<0.01），大鼠肝組織HE與Masson染色結(jié)果也表明五田保肝液各治療組在肝組織病變程度與膠原表達(dá)方面較模型組有明顯減輕，這說明五田保肝液能夠有效抑制酒精性肝纖維化的發(fā)展，提示其有良好的保肝作用。

轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）與肝纖維化密切相關(guān)，是促進(jìn)肝纖維化的重要生長因子，在纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用[5]，在本實(shí)驗(yàn)中，五田保肝液各治療組與模型組比較肝組織TGF-β1mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.01），說明五田保肝液在降低血清PⅢP、LN水平的同時(shí)降低了TGF-β1mRNA表達(dá)，提示五田保肝液可能通過降低肝組織TGF-β1來起到抗纖維化作用。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，中等劑量的五田保肝液降低血清PⅢP、LN水平及TGF-β1mRNA表達(dá)效果最好，而高劑量的五田保肝液卻略有降低，這說明中等劑量的五田保肝液保肝效果最好，可能原因是五田保肝液的作用效果在中等劑量時(shí)達(dá)到峰值，其具體機(jī)制還須進(jìn)一步研究。

[1]丁 霞,蒙一純,賁長恩,等.酒精性肝纖維化動(dòng)物模型的建立[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,1999,5(7)：18-20.

[2]丁 霞,楊晉翔,王 婧,等.酒精性肝纖維化中醫(yī)證素分析[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2009,15(2):136-137.

[3]丁 寧.肝纖維化形成機(jī)制的研究進(jìn)展[J].臨床肝膽病雜志,2009,25(1):73-77.

[4]張 萍,李曉斐,劉慶麗.檢測血清中LN、CIV、PⅢP、HA的含量對肝纖維化及肝硬化的診斷價(jià)值[J].醫(yī)藥世界,2007,9(1):46-47.

[5]李雪萍,王煥英.轉(zhuǎn)化生長因子β1與肝纖維化關(guān)系[J].中國實(shí)用醫(yī)藥,2009,33(4):227-228.