Labrasol對葛根素角膜透過性的研究*

舒樂新，趙啟鐸，劉志東，李 琳，宋西衛(wèi)，李 楠

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程研究中心研究生，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

角膜上皮是藥物眼部吸收的主要屏障，角膜上皮的滲透性較差。常規(guī)滴眼劑存在滯留時間短、生物利用度低（僅為1%～10%）、患者順應(yīng)性差等問題。應(yīng)用滲透促進(jìn)劑能夠改善角膜的透過性，增加藥物的跨膜吸收[1]。

葛根素（PUE）是一種異黃酮類化合物，可從豆科植物野葛[Puerarialobata（Willd.）Ohwi]的干燥根中提取得到。葛根素具有β受體阻滯作用和改善微循環(huán)作用,近年來在青光眼的治療中得到了廣泛地應(yīng)用。辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol）是一種新型的吸收促進(jìn)劑，被廣泛用于口服和經(jīng)皮給藥系統(tǒng)[2]。

實(shí)驗主要考察將Labrasol作為滲透促進(jìn)劑應(yīng)用于眼用制劑，前期實(shí)驗考察了Labrasol在質(zhì)量濃度為0.5%～3%內(nèi)沒有刺激性[3]。采用離體角膜透過技術(shù)，研究其對葛根素的角膜透過率的影響，并對Labrasol的作用機(jī)制進(jìn)行探討，從而明確Labrasol作為一種新型的吸收促進(jìn)劑是否有好的眼用促滲作用，為以后的眼用促滲劑提供基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

TK－20A型透皮擴(kuò)散試驗儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司），改良的Franz擴(kuò)散池（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司），Milli－Q 超純水系統(tǒng)（Millipore，美國），AX205電子天平（METTLER TOLEDO，瑞士），高效液相色（HPLC）譜儀（島津，SPD－10AvpUV－VIS DETECTOR，LC －10ATvp，LIQUID CHROMATOGRAPH，日本）。葛根素對照品（天津馬克生物技術(shù)有限公司純度99%），葛根素原料藥（純度>90%，西安賽幫醫(yī)藥有限公司），Labrasol（Gattefosse，法國），其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 擴(kuò)散介質(zhì) 以谷胱甘肽一碳酸氫鈉林格溶液(GBR)為擴(kuò)散介質(zhì)。文獻(xiàn)[4]報道，該生理溶液可保存離體角膜達(dá)6 h。它由2部分溶液組成,一部分含氯化鈉12.400 g/L、氯化鉀0.716 g/L、磷酸二氫鈉0.206 g/L、碳酸氫鈉4.908 g/L;另一部分含氯化鈣0.230 g/L、氯化鎂 0.318 g/L、葡萄糖 1.800 g/L、谷胱甘肽（氧化型）0.184 g/L。上述2溶液低溫儲存，用前等量混合。

2.2 Labrasol對葛根素角膜透過率的影響 將家兔耳緣靜脈注射空氣致死。在死后20 min內(nèi)用眼科手術(shù)剪和鑷子小心分離出角膜，除去鞏膜、虹膜、睫狀體等多余組織。將新鮮離體角膜小心固定在Franz擴(kuò)散池的供給池和接受池之間，使上皮層面向供給池，在接受池中加入新鮮配制的GBR溶液4.5 mL，在供給池中加入含0.2%藥物的不同濃度的Labrasol溶液0.5 mL。裝置置于透皮擴(kuò)散實(shí)驗儀中，溫度控制在（37±1）℃。實(shí)驗開始后，分別在 40、80、120、160、200、240 min從接受池中取樣4.5 mL，同時補(bǔ)充等體積同溫的GBR溶液，樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，用HPLC測定。

2.3 數(shù)據(jù)處理 單位面積累積透過量Q可由下式求算：

其中Cn為時間藥物的測定濃度，Ci為時間前的測定濃度，V0為接受池中溶液體積，V為取樣體積。表觀滲透系數(shù)（Papp,cm/s）定義為：其中C0為供給池初始藥物濃度；A為有效透過面積；△Q/△t可由累積透過量—時間曲線穩(wěn)態(tài)部分的斜率求得。

表觀滲透系數(shù)以兩獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2.4 角膜水化值的測定 將體外實(shí)驗后暴露于擴(kuò)散介質(zhì)的角膜區(qū)域稱其質(zhì)量,記為m；60℃干燥15 h后再次稱其質(zhì)量，記為ma。角膜水化值按下式計算：

2.5 樣品的測定

2.5.1 色譜條件 HPLC法測定樣品中葛根素含量。色譜柱：Diamond DIKMA ODS－C18（200 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：甲醇：1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）檸檬酸溶液（體積比 35∶65），流速:1 mL/min，檢測波長：250 nm，進(jìn)樣量：20 μL，柱溫：30 ℃，色譜圖見圖1。

2.5.2 專屬性考察 取不加藥物的空白角膜內(nèi)容物GBR溶液20 μL，注入高效液相中，色譜圖見圖2。

如圖可見空白角膜內(nèi)容物對葛根素?zé)o干擾。

2.5.3 方法學(xué)考察 精密配制一系列質(zhì)量濃度分別為0.016～0.8 mg/L和0.8～16 mg/L的葛根素GBR溶液，進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。樣品質(zhì)量濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程分別為 A＝1.1061×104C＋552.33（r＝0.9999）和 A＝1.16259×105C－ 2.0998×103（r＝0.9999）。由相關(guān)系數(shù)可知樣品質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。分別在2個范圍內(nèi)配低、中、高3個質(zhì)量濃度的葛根素GBR溶液0.032、0.128、0.560mg/L和1.6、8.0、16.0 mg/L。測得日內(nèi)精密度峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.0%、1.2%、0.1%和0.5%、0.7%、0.5%。日間精密度RSD分別為1.2%、0.9%、0.6%和0.4%、1.0%、0.7%，說明儀器精密度良好。

3 結(jié)果

3.1 Labrasol對葛根素角膜透過性的影響 本實(shí)驗以0.2%的葛根素GBR液為對照，分別考察了0.5%、1%、1.5%、2%、3%的 Labrasol為促滲劑時葛根素的角膜透過性。葛根素離體角膜透過參數(shù)見表1，透過曲線方程圖見圖3。

如圖3，葛根素的表觀滲透系數(shù)隨著Labrasol濃度的升高而增大，Labrasol濃度為 0.5%、1%、1.5%、2%、3%時，葛根素的表觀滲透系數(shù)分別是對照組的 1.87倍、4.41倍、7.42倍、8.02倍、9.60倍，與對照組比都有顯著性差異。

3.2 Labrasol對角膜水化值的影響 角膜水化值是體外評價物質(zhì)對該組織刺激性的重要指標(biāo)，以此來考察促滲劑對角膜的損傷，正常的角膜水化值為76%～80%，超過83%，即可判定角膜受到一定程度的損傷[5]。實(shí)驗中葛根素不同濃度的Labrasol對角膜水化值沒有顯著影響，表明實(shí)驗過程中沒有對角膜上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷，見表1。

表1 Labrasol對葛根素離體角膜透過參數(shù)影響(±s，n=3)Tab.1 The Effect of Labrasol on the transcorneal permeability coefficient of PUE(±s，n=3)

表1 Labrasol對葛根素離體角膜透過參數(shù)影響(±s，n=3)Tab.1 The Effect of Labrasol on the transcorneal permeability coefficient of PUE(±s，n=3)

注：與對照組比較，*P<0.01。

r2組別對照0.5%Labrasol 1%Labrasol 1.5%Labrasol 2%Labrasol 3%Labrasol線性方程Q=0.011 4t－0.="tb Q=0.021 3t－0.21 t Q=0.050 0t－2.50 t Q=0.077 3t－2.77 t Q=0.090 8t－2.90 t Q=0.109 0t－3.09 t 0.99320.99190.98600.99490.99430.9956 Papp×106（cm/s）1.86±0.273.47±0.45*8.21±1.67*13.8±1.93*14.92±1.88*17.85±1.76*角膜水化值/%77.07±1.0880.03±0.6579.46±1.6179.48±1.2181.67±1.1482.17±0.60

4 討論

實(shí)驗考察了0.5%～3%的Labrasol對葛根素的角膜透過性，結(jié)果葛根素的表觀滲透系數(shù)隨著Labra sol濃度的增加而增大，是對照組的1.87倍到9.60倍，與空白比都有顯著性差異（P＜0.01），表明Labrasol對葛根素有很好的促滲作用。

Labrasol增加藥物角膜滲透性的機(jī)制主要有兩種。第1種，通過破壞角膜細(xì)胞膜，或者通過滲透進(jìn)入細(xì)胞膜，或者通過從細(xì)胞膜提取脂溶性的物質(zhì)如膽固醇和磷脂來增加藥物的角膜透過量。第2種，作為藥物載體，通過保持藥物在溶液中的親水性，經(jīng)過黏蛋白層將藥物傳遞到角膜表面，然后以擴(kuò)散的方式透過角膜進(jìn)入眼組織。

由實(shí)驗結(jié)果可知,葛根素的表觀滲透系數(shù)隨著Labrasol濃度的升高而增大，當(dāng)Labrasol的濃度為1.5%時達(dá)到一個平臺區(qū)，統(tǒng)計學(xué)比較組間差異1.5%、2%與 3%，這 3組間沒有差異（P＞0.05），表明在統(tǒng)計意義上沒有增大，達(dá)到了平衡。因此，Labrasol的作用機(jī)制可能是兩種作用機(jī)制共同作用的結(jié)果。當(dāng)Labrasol的濃度較低時，葛根素的表觀滲透系數(shù)隨Labrasol濃度的增加而增加，第1種作用機(jī)制可能起主要作用。當(dāng)Labrasol的濃度較高時，第2種作用機(jī)制可能起主要作用。當(dāng)存在過量的Labrasol時，葛根素的表觀滲透系數(shù)隨Labrasol濃度的增加而不再增加，達(dá)到平衡。

由此表明一定濃度的Labrasol可顯著提高葛根素的角膜透過率，且對角膜無刺激性，因此在實(shí)踐中可被廣泛應(yīng)用。

[1]ASHIM K.Ophthalmic Drug Delevery Systems[M].2nd Missouri,USA:Marcel Dekker,Inc,2000:218-220.

[2]Sateesh K,Ramesh P.Nanoemulsions as Versatile Formulations for Paclitaxel Delivery:Peroral and Dermal Delivery Studies in Rats[J].J Invest Dermatol,2007,127(1):154-159.

[3]張欣華,劉志東,張伯禮,等.Labrasol對兔眼刺激性評價[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2009,28(7):838-840.

[4]ROJANESEKUL Y,ROBINSON JR.Transport mechanisms of the cornea.Characterizatim of barrier permselectivity[J].Int J Pharm,1989,55(2-3):237-239.

[5]Saettone MF,Chetom P,Cerbai R,etal.Evaluation of ocular permeation enhancers in vitor effects on corneal transport of four blockers，and in ivtro/in vivo toxic activity[J].Int J Pharm,1996,142:103-109.