復方益腎膠囊對大鼠糖尿病腎病的藥效學研究*

宮凌濤 ，李桂霞 ，曹永剛 ，陳淑欣 ，王亞賢

(哈爾濱醫科大學大慶校區藥理教研室，大慶 163319；2.哈爾濱醫科大學大慶校區中藥教研室，大慶 163319）

糖尿病腎病（DN）是糖尿病（DM）的主要并發癥和致死原因之一，占DM慢性并發癥住院患者的33.6%[1]，基本病變為腎小球基底膜（GBM）增厚和系膜基質增生。其特征性病變是結節性腎小球硬化，也可表現為彌漫性腎小球硬化癥及腎小球滲出性損害[2]。DN的發病機制十分復雜，目前尚未完全闡明。DN一旦形成治療是困難的，預防是重點,中醫藥對糖尿病腎病的治療有獨特的優勢和治療特色。因此筆者采用中醫辨證理論，配以中藥土鱉蟲為主藥組成的復方益腎膠囊。通過對大鼠腎小球基底膜的組織學觀察和腎功能檢查，發現該藥對治療糖尿病腎病有確切療效。

1 材料和方法

1.1 動物 健康雄性Wistar大鼠70只，清潔級，體質量180～220 g，由哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供。適應性飼養7 d，尿檢陰性，健康狀況良好。

1.2 實驗器材 大鼠血壓測定儀（日本，KN-210）；血糖測定儀（日本京都1810）；Leica RM 2135病理切片機、Leica EG1160病理包埋機、Leica DM 4000B-DFC 300 FX數據成像系統（德國Leica公司產品）。

1.3 實驗試劑及藥物 鏈尿佐菌素（STZ，Sigma公司提供）。馬來酸依那普利，石家莊藥業集團歐意藥業有限公司，批號：國藥準字H20055813，生產批號：0808201，規格：5 mg/片。復方益腎膠囊由哈爾濱醫科大學大慶校區中藥制劑室提供。

1.4 藥物配制土鱉蟲水提物 土鱉蟲水浸12 h，勻漿后于65℃恒溫水浴4 h，過濾定容成2 kg/L。土鱉蟲脂取物：土鱉蟲正丁醇萃取液濃縮成2 kg/L。復方益腎膠囊：附桂地黃丸組成加枸杞、益母草制成顆粒后與土鱉蟲實驗優化結果結合裝入膠囊備用，0.40 mL/膠囊（含生藥 0.70 g）。

2 實驗方法

2.1 動物模型的建立[3-4]選擇Wistar雄性大鼠70只,180～220 g。隨機選10只設為空白對照組，普通喂養。余60只喂以高脂飼料（基礎飼料加蔗糖、煉豬油、膽固醇等混合而成，比例為 6∶5∶25∶1），1 周后將STZ1.5 g溶于0.1 mol/L配制的檸檬酸三鈉—檸檬酸緩沖液（pH值為 4.5）300 mL中,含檸檬酸三鈉882 mg，含檸檬酸630 mg，給大鼠STZ25 mg/kg腹腔注射,連續4周,繼續喂以高脂飼料，同時給予青霉素預防感染。4周后尾靜脈采血測定空腹血糖（禁食8h）及糖耐量實驗（OGTT）2 h后血糖（根據OGTT成人75 g/次的國際標準以大鼠體表系數換算），空腹血糖≥13.8 mmol/L或OGTT2 h后血糖≥16.7 mmol/L大鼠造模成功，造模時間共5周。

2.2 分組 挑選造模成功50只糖尿病腎病大鼠，隨機分成糖尿病模型組、土鱉蟲水提物組、土鱉蟲脂取物、復方益腎膠囊組、陽性藥物對照組（依那普利治療組），10只/組，與空白對照組，共6組。

2.3 各組藥物 均以混懸液灌胃。陽性藥物（依那普利）對照組、土鱉蟲水提物組、土鱉蟲脂取物、復方益腎膠囊組每次分別 0.2 mg/只、2.5 mL/只、2.0 mL/只、2膠囊/只，2次/d灌胃；空白對照組和糖尿病模型組灌胃等量生理鹽水；各組每日灌胃2次，連續6周。

2.4 觀測指標 尿微量白蛋白（MALB）；血肌酐和尿素氮；腎臟組織病理檢查。

2.5 標本采集與檢測 12周末測大鼠體質量、飲水量，置大鼠于代謝籠中收集24 h尿液，測其總量，取出1～3 mL備用，采用比色法測定尿蛋白含量，換算24 h尿蛋白量。大鼠禁食不禁水12 h，各組隨機選8只經5%戊巴比妥鈉麻醉后，心臟取血，測定大鼠空腹血糖，血肌酐和尿素氮。剖腹取出左腎、自腎門處切成兩片，10%中性甲醛固定，常規脫水、透明、石蠟包埋，連續4 μm切片，固定于載玻片上，進行PAS染色，光鏡病理檢測。

2.6 統計學方法 采用SPSS軟件分析系統處理結果，數據用均數±標準差（±s）表示，組間采用單因素方差分析。

3 結果

實驗過程中,復方益腎膠囊組10只、糖尿病模型組10只（2只死亡），糖尿病模型組表現出典型的多食、多飲、多尿、明顯消瘦，皮毛無光澤。

3.1 糖尿病腎病腎小球的病理改變 腎臟外觀可見各造模組大鼠腎臟體積增大，皮質增厚而蒼白，腎乳頭壞死、脫落。PAS染色顯示腎小球肥大，腎小球基底膜和腎小管基底膜增厚。腎小球系膜基質增多；腎小球出現無細胞性結節狀硬化（K－W結節形成）。腎小球毛細血管袢的纖維素樣或類脂樣帽狀病變。腎小球毛細血管微血管瘤形成；腎小球入球小動脈和出球小動脈玻璃樣變。提示糖尿病腎病模型制備成功。復方益腎膠囊組對上述病變均有改善。見圖1。

3.2 對大鼠空腹血糖、體質量、腎功能、24 h尿蛋白定量的影響

3.2.1 復方益腎膠囊對大鼠空腹血糖、體質量的影響 見表1。

表1 復方益腎膠囊對大鼠空腹血糖、體質量的影響（±s）Tab.1 Effect of compound tonifying kidney capsule on blood-fasting sugar and body weight in rats（±s）

表1 復方益腎膠囊對大鼠空腹血糖、體質量的影響（±s）Tab.1 Effect of compound tonifying kidney capsule on blood-fasting sugar and body weight in rats（±s）

注：與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與糖尿病模型組比較，*P＜0.05 ，**P＜0.01；與陽性對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別空白對照組糖尿病模型組土鱉蟲水提物組土鱉蟲醇取物組復方益腎膠囊組陽性藥物對照組n 108991010體質量（g）334±5.1180±4.8△△212±5.2△△*▲258±5.6△△**282±4.9△**▲268±5.3△△**空腹血糖（mmol/L）5.67±0.3421.32±2.42△△19.76±2.52△△*▲16.23±2.23△△**▲▲13.46±1.87△△**▲▲20.68±2.31△△

由表1可見，糖尿病腎病模型組大鼠空腹血糖持續升高,日飲水量增多,尿量增多，體質量減少，與空白對照組比較均有非常顯著性差異（P＜0.01）；土鱉蟲脂取物組、復方益腎膠囊治療組的大鼠空腹血糖明顯降低，與糖尿病模型組、陽性藥物對照組比較差異顯著（P＜0.01）；土鱉蟲水提物組也有一定程度降低血糖（P＜0.05）；陽性藥物依那普利無明顯降血糖作用。

3.2.2 復方益腎膠囊對大鼠腎功能、24 h尿蛋白定量的影響 見表2。

由表2可見，糖尿病腎病模型組大鼠24 h尿蛋白、血肌酐、尿素氮明顯增加，與空白對照組比較有顯著差異（P<0.01），復方益腎膠囊治療組24 h尿蛋白、血肌酐明顯下降，與糖尿病模型組比較均有非常顯著性差異（P＜0.01）；土鱉蟲脂取物組對腎功能（24 h尿蛋白、血肌酐）有一定程度改善（P＜0.05），土鱉蟲水提物組對腎功能無改善；復方益腎膠囊組和陽性藥物對照組對尿素氮有降低（P<0.05），但其他治療組不明顯。說明提示復方益腎膠囊在減少尿蛋白、血肌酐、尿素氮方面優于土鱉蟲水提物組和土鱉蟲脂取物組，而與陽性藥物對照組相近。

表2 復方益腎膠囊對大鼠腎功能、24 h尿蛋白定量的影響(±sTab.2 Effect of compound tonifying kidney capsule on the function of the kidney and protein quality for 24 h(±s

表2 復方益腎膠囊對大鼠腎功能、24 h尿蛋白定量的影響(±sTab.2 Effect of compound tonifying kidney capsule on the function of the kidney and protein quality for 24 h(±s

注：與空白組比較，△P<0.05，△△P<0.01;與糖尿病模型組比較，*P<0.05 ，**P<0.01；與陽性對照組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01 。

組別空白對照組糖尿病模型組土鱉蟲水提物組土鱉蟲醇取物組復方益腎膠囊組陽性藥物對照組10 n 1089910血肌酐（μmol/L）45.20±3.1567.46±4.18△△62.48±3.79△△▲▲54.62±3.18△△*▲51.58±1.39△△**51.27±3.25△△**尿素氮（mmol/L）6.67±1.3419.89±2.56△△19.28±2.26△△▲19.81±2.48△△▲18.67±2.38△△*18.58±2.53△△*尿蛋白（mg/24 h）7.58±3.1227.23±3.47△△23.58±3.56△△*▲▲20.46±3.43△△**▲16.56±3.58△△**16.83±3.28△△**

4 討論

尿蛋白是各種腎臟疾病進展為終末期腎病的危險因素,DN是引起慢性進展性腎病最重要的原因[5]。尿蛋白的增多與糖尿病腎病的進程密切相關,DN的基本病機為氣虛血瘀,并且貫穿于疾病的全病程，其機制主要與腎小球上皮細胞受損和數量的減少有關[6]。中醫學認為，2型糖尿病主要以氣陰兩虛為主，在治療方法多以益氣、滋陰的藥物為主，而忽略了對其并發癥的治療，本課題研究主要針對其并發癥腎病的實驗研究，根據中醫絡脈理論和絡病學說中“久病入絡”、“久病入血”、“久病入腎”及“病入絡為瘀”的觀點，現代研究所證實糖尿病血管病變存在瘀血阻絡的病理改變的特點，以及中醫的“久病傷陰，陰損及陽”的特點[7]，筆者認為腎絡瘀阻，陰陽兩虛是DN微血管病變的病機。因此筆者根據中醫方劑藥物配伍理論，以張仲景名方金匱腎氣丸為基本組成，加以活血化瘀藥組成復方益腎膠囊,主要功效為化瘀散結，益氣扶正。王怡等[8]利用多種方法測定了5種蟲類藥對血液流變性的影響，結果顯示土鱉蟲對血液流變性各參數的改善作用最強；同時土鱉蟲還可降低血脂。以活血化瘀藥土鱉蟲為君藥,以山茱萸、桂枝、熟地黃、枸杞等養陰助陽中藥為輔藥，從整體上來治療DN微血管病變。

研究結果表明，DN動物模型的血糖持續升高，日飲水量增多為正常鼠的8～9倍；尿量增多約為正常鼠的10～11倍，體質量減少，符合糖尿病的“三多一少”特型特征;同時尿白蛋白顯著增多，表現為糖尿病腎損傷的癥狀。各造模組大鼠血尿素氮升高，病理檢測呈現彌漫性糖尿病腎小球硬化癥和結節性糖尿病腎小球硬化癥。復方益腎膠囊治療后模型大鼠空腹血糖、24 h尿蛋白、血肌酐明顯下降,飲水量和尿量顯著減少，體質量增加，依那普利治療組飲水量和尿蛋白顯著減少,血糖和尿量沒有明顯變化;復方益腎膠囊和依那普利對降低DN模型大鼠升高的血尿素氮有一定作用。提示復方益腎膠囊有降低血糖、減少尿蛋白、血肌酐、尿素氮、減少DN大鼠飲水量和尿量的作用。

[1]中華醫學會糖尿病分會慢性并發癥調查組.1991-2000年全國住院糖尿病患者慢性并發癥及相關大血管病變回顧性分析[J].中華醫學科學院學報，2002，24（5）：447-451.

[2]黎磊石.進一步重視糖尿病的防治研究[J].中華醫學雜志，1999，7（9）：327-328.

[3]周迎生，高 巖，李 斌，等.高脂喂養聯合聯合鏈尿佐菌素注射的糖尿病大鼠模型特征[J].中國實驗動物學報，2005，13（3）：154-158.

[4]馬淑珍,杜 鵑,馬俐儒.鏈尿佐菌素誘導糖尿病大鼠血尿滲透壓的變化極其意義[J].中國實驗診斷學,2008,8(12):977-978.

[5]張麗芬,趙進喜,呂仁和，等.糖尿病腎病腎功能不全防治優化方案的有效性和安全性研究[J].中醫雜志,2006,47(10):755-756.

[6]陳濟德，司延林.糖腎復原湯對大鼠早期糖尿病腎臟損害療效的實驗研究[J].基礎研究,2008,24(8):30-31.

[7]雷 艷，黃起福，王永炎，等.論瘀毒阻絡是絡病形成的病理基礎[J].北京中醫藥大學學報,1999,22(2):8-9.

[8]王 怡.動物類活血化瘀藥對血液流變性作用的比較研究[J].中藥藥理與臨床 1997，13（3）：1-4.