止喘湯對哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重塑的影響*

張占鋒，霍博雅

（1.河南省鄢陵縣人民醫(yī)院內(nèi)科，鄢陵 461200；2.遼寧醫(yī)學院第三醫(yī)院中醫(yī)科，錦州 121001）

哮喘是由多種細胞及細胞因子參與的慢性氣道炎癥性疾病，其發(fā)病率、病死率均呈逐年上升的趨勢。哮喘反復發(fā)作可引起氣道重塑，導致不可逆性氣流阻塞及持續(xù)性氣道高反應性，只有控制或者逆轉(zhuǎn)了氣道重塑，哮喘才可能得到真正意義上的控制。中醫(yī)治療哮喘有著豐富的臨床經(jīng)驗，本實驗通過對致敏大鼠反復霧化吸入抗原建立慢性哮喘模型，觀察中藥復方早期干預對哮喘大鼠氣道炎癥和重塑的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及模型制備 8周齡SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g（遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供），隨機分成4組隨機分為4組：正常組、哮喘組、布地奈德（BUD）組和止喘湯組，每組10只。參照Holgate等[1]的方法復制大鼠慢性哮喘模型。第1、8天腹腔注射10%的卵蛋白（OVA）（GradeⅢOVA，SigmaA5378）混懸液1mL（內(nèi)含OVA 100 mg、氫氧化鋁100 mg）致敏，自15 d始分別將各組大鼠鼠置于30 cm×30 cm×40 cm有進出兩口的有機玻璃箱內(nèi)，以1%OVA溶液霧化吸入，0.5 mL/min，30 min/次，1次/d，共6周。止喘湯組：每次激發(fā)前30 min中藥灌胃（取生藥500 g，分別加8倍量的水，分別提取2次，每次1 h，過濾，常壓濃縮至500mL，由遼寧醫(yī)學院第三醫(yī)院中藥制劑室提供），按大鼠體質(zhì)量（10 mL/kg）給予。BUD組：激發(fā)前30 min生理鹽水灌胃及5 mL∶1 mg BUD（阿斯利康制藥有限公司，批號國藥準字 H20030410，規(guī)格 5 mL∶20 mg）霧化吸入。哮喘組生理鹽水灌胃；正常組腹腔注射、灌胃及霧化吸入分別以生理鹽水代替。以大鼠呼吸急促、口唇發(fā)紺、點頭呼吸及站立不穩(wěn)等表現(xiàn)為模型建立成功的標志。

1.2 標本采集 各組大鼠均于末次激發(fā)24 h內(nèi)取材。20%烏拉坦5 mL/kg腹腔麻醉，剪開頸部皮膚，鈍性分離頸動脈，取血2 mL置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，采用常規(guī)計數(shù)法測定白細胞總數(shù)及其分類。打開胸腔，結(jié)扎右主支氣管，分離出頸部氣管，參考文獻[2]方法進行左側(cè)支氣管肺泡灌洗，將收集的支氣管肺泡灌洗液（BAL）盛入15 mL塑料離心管（置于冰浴中），重復上述操作4次，收集全部 BAL（回收率＞85%）計量后取少量在改良的Neubauer計數(shù)臺上計數(shù)BAL中白細胞總數(shù)，余下的BAL 4℃離心（1500 r/min）10 min，取細胞沉淀涂片、瑞氏染色后在油鏡下作白細胞分類計數(shù)。放血后取右肺中葉肺組織置于4%的多聚甲醛中抽氣固定48 h后，進行脫水，透明，垂直于氣道取材，石蠟包埋，切片，片厚4 μm，切片按HE常規(guī)染色步驟染色。

1.3 氣道炎癥和氣道壁厚度測定 蘇木精-伊紅（HE）染色后，每組隨機抽取10張切片，400倍光鏡下選擇內(nèi)徑100～200 μm的細支氣管區(qū)，采集5處視野，計數(shù)單位氣道面積（2200 μm2）的炎性細胞數(shù)，以評估氣道炎癥[3]；每張切片選取3支內(nèi)周長（支氣管基底膜周徑）為1000～3000 μm的膜性大、中級小支氣管，在100倍光鏡下參照文獻[4]用病理圖像分析系統(tǒng)，測定支氣管基底膜周徑（Pbm）、總管壁面積（Wat）、平滑肌面積（Wam），并用Pbm將測量值標準化，分別以Wat/Pbm、Wam/Pbm表示，代表相應管壁層的厚度。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血、BAL中嗜酸性細胞計數(shù)的變化情況 哮喘組與正常組比較外周血、BAL中嗜酸粒細胞（EOS）明顯升高（P＜0.01）；應用藥物干預后，治療組與哮喘組相比較，上述指標明顯下降（P＜0.01）；止喘湯與BUD組比較上述指標間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。結(jié)果見表1－表2。

表1 各組間外周血白細胞總數(shù)及分類計數(shù)的比較（±s）Tab.1 Comparison of total and differential counts of Leukocyte in PB in different groups（±s）×109個/L

表1 各組間外周血白細胞總數(shù)及分類計數(shù)的比較（±s）Tab.1 Comparison of total and differential counts of Leukocyte in PB in different groups（±s）×109個/L

注：與正常組比較▲P<0.01，與哮喘組比較★P<0.01，與BUD組比較▼P>0.05。

組別正常組哮喘組BUD組止喘湯組n 10101010細胞總數(shù)9.9321±1.489240.1859±5.1696▲22.7128±3.3706★24.1346±1.9981★嗜酸粒細胞0.3839±0.09160.1565±0.0179▲0.0777±0.0209★0.0805±0.0155★淋巴細胞6.7447±0.989114.4961±1.8684▲9.6860±1.7925★10.0282±2.3649★

表2 各組間BAL白細胞總數(shù)及分類計數(shù)的比較Tab.2 Comparison of total and differential counts Leukocyte of BAL in different groups（±s）×109個/L

表2 各組間BAL白細胞總數(shù)及分類計數(shù)的比較Tab.2 Comparison of total and differential counts Leukocyte of BAL in different groups（±s）×109個/L

注：與正常組比較▲P<0.01，與哮喘組比較★P<0.01，與BUD組比較▼P>0.05。

組別正常組哮喘組BUD組止喘湯組n 10101010細胞總數(shù)3.6521±0.335910.5212±1.0067▲6.3331±0.7999★6.9139±0.4488★嗜酸粒細胞0.0133±0.00210.0379±0.0039▲0.0243±0.0025★0.0261±0.0028★淋巴細胞0.7481±0.06953.2847±0.3895▲1.8291±0.1799★1.9740±0.1604★

2.2 病理形態(tài)學觀察 HE染色顯示，正常組支氣管、肺組織結(jié)構(gòu)正常，各級支氣管上皮完整，肺泡間隔正常，無明顯炎性細胞浸潤；哮喘組支氣管黏膜上皮大片壞死和脫落，管壁以嗜酸粒細胞和淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤明顯，肺泡間隔、平滑肌和基底膜增厚；治療組支氣管黏膜上皮部分脫落，少量炎性細胞浸潤，肺泡間隔、平滑肌和基底膜較空白對照組略有增厚。見圖1。

2.3 氣道炎性細胞計數(shù)和形態(tài)學指標測定結(jié)果單位氣道面積內(nèi)，哮喘組和治療組炎性細胞計數(shù)高于正常組，哮喘組高于治療組（均P＜0.01）。但治療組間炎性細胞計數(shù)無明顯差異（P＞0.05）。形態(tài)學指標顯示，哮喘組較對照組和治療組氣道壁厚度明顯增加（均 P＜0.01），BUD 組與止喘湯組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。結(jié)果見表3。

表3 氣道炎性細胞計數(shù)和形態(tài)學指標測定結(jié)果（±s）Tab.3 Counts of airway inflammatory cell and Morphological Indexes in different groups（±s）

表3 氣道炎性細胞計數(shù)和形態(tài)學指標測定結(jié)果（±s）Tab.3 Counts of airway inflammatory cell and Morphological Indexes in different groups（±s）

注：與正常組比較▲P<0.01，與哮喘組比較★P<0.01，與BUD組比較◆P>0.05；各組間比較▼P>0.05。

Pbm（Hm）組別Wat/Pbm正常組哮喘組BUD組止喘湯組炎性細胞（Wat）（個/2,200 μm2）11.65±1.2929.52±4.54▲16.81±3.37★18.43±2.00★◆1677.92±178.111663.93±292.021680.48±202.361728.67±239.5352.26±5.9477.92±9.47▲63.20±4.74★64.44±6.78★◆Wam/Pbm（μm2/μm）12.74±2.1429.96±4.50▲22.60±2.37★23.34±2.76★◆

3 討論

病理學研究表明，哮喘的病理改變涉及整個支氣管樹，炎性細胞浸潤不僅累及氣道壁，也出現(xiàn)于外周肺組織。Th2反應介導的嗜酸粒細胞浸潤已被認為是哮喘氣道炎癥的一個顯著特征。氣道重塑是哮喘的重要病理特征之一，成為哮喘近年來研究的熱點之一，但其發(fā)生機制并未完全闡明。現(xiàn)被普遍接受的提法是由于急性炎癥反復發(fā)作而轉(zhuǎn)變?yōu)槁匝装Y，氣道反復損傷與修復，大量炎癥細胞、炎癥介質(zhì)浸潤并繼發(fā)氣道重塑[5]。

中醫(yī)認為哮喘的病因是先天不足、臟腑失調(diào)，宿痰內(nèi)伏、外邪觸發(fā)，病久瘀血，以虛實夾雜、本虛標實為特征。止喘湯（黨參、白術、茯苓、甘草、桑白皮、杏仁、葶藶子、黃芩、丹參、川芎）是基于哮喘基本病機證型的復方，由定喘湯合四君子湯加減而成。全方具有補益肺脾腎、活血化瘀、清泄肺熱、祛痰止咳平喘，為根據(jù)多年臨床經(jīng)驗研制的自擬中藥合劑，臨床應用效果良好。現(xiàn)代藥理研究方中的甘草、杏仁、黃芩、丹參、川芎等都有不同的治療哮喘的作用。

本實驗應用大鼠建立慢性哮喘模型，觀察中藥復方止喘湯對致敏大鼠抗原激發(fā)所產(chǎn)生的氣道炎癥及氣道重塑的影響。結(jié)果表明，致敏大鼠分別經(jīng)過長期反復抗原激發(fā)，出現(xiàn)了支氣管壁及支氣管肺泡內(nèi)以嗜酸粒細胞浸潤為主的炎癥反應，氣道壁本身亦出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)性變化，表現(xiàn)為氣道壁的增厚、支氣管黏膜上皮脫落、上皮下纖維化、平滑肌細胞的增生肥大等，這些均為氣道重塑的特征性病理改變。筆者發(fā)現(xiàn)止喘湯不僅可以抑制氣道炎癥，降低外周血、BAL中EOS數(shù)量，而且能有效預防氣道重塑的發(fā)生。提示止喘湯可能通過減少EOS氣道浸潤控制氣道炎癥，減輕和延緩氣道重塑；也可能通過其他途徑如炎性介質(zhì)或細胞因子等對氣道炎癥和重塑起作用[6]；還可能本身就有抗氣道重塑的作用；明確機制有待進一步研究。本實驗結(jié)果可為止喘湯作為哮喘臨床辨證治療的基礎方提供實驗理論依據(jù)。

[1]Holgate ST,Peters-Golden M,Panettieri RA,et al.Roles of cysteinyl leukotrienes in airway inflammation,smooth muscle function,and remodeling[J].J Allergy Clin Immunol,2003,111(1):18-34.

[2]史 菲,邱 晨.大鼠支氣管肺泡灌洗術標準化操作的探討[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2002,12(4):67-69.

[3]Henderson WR Jr,Tang LO,Chu SJ,et al.A role for cysteinyl leukotrienes in airway remodeling in a mouse asthma model[J].Am J Respir Crit Care Med,2002,165(1):108-116.

[4]Pascual RM,Peters SP.Airway remodeling contributes to the progressive loss of lung function in asthma:an overview[J].J Allergy Clin Immunol,2005,116(3):477-486.

[5]Cohn L,Elias JA,Chupp GL.Asthma:mechanisms of disease persistence and progression[J].Annu Rev Immunol,2004,22:789-815.

[6]劉仁慧,郭 忻,趙宇昊.中藥復方抗支氣管哮喘模型氣道慢性炎癥的機制研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2007,34(10):1836-1837.