優化建立iPS細胞的新方法

摘要自從2006年，Takahashi和Yamanaka首次報道了通過逆轉錄病毒的轉導，利用4中轉錄因子Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc將鼠成纖維細胞誘導為iPS細胞后，許多實驗室建立了新的方法優化和改善重編程技術。本篇綜述從重編程基因的刪除策略，非整合策略，非DNA策略，提高iPS細胞的建系效率等幾個方面著重介紹了建立iPS細胞的新方法。

關鍵詞iPS細胞 策略 hECS

中圖分類號:Q2文獻標識碼:A

0 引言

自從2006年，Takahashi和Yamanaka[1]首次報道了通過逆轉錄病毒的轉導，利用4中轉錄因子Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc將鼠成纖維細胞誘導為iPS細胞后，許多實驗室建立了新的方法優化和改善重編程技術。目前，仍存在一些重要的限制條件和缺陷，使iPS細胞不能應用于臨床治療和體外分析:(1)病毒載體系統會永久性地插入受體細胞基因組中，引起插入突變，并遺傳給下一代。同時，由于引入了外源DNA，這種插入也會使腫瘤形成的幾率大大增加。(2)盡管c-Myc在iPS細胞產生過程中是非必需的，Oct4和 Klf4的異位表達也會引起發育異常。本篇綜述從重編程基因的刪除策略，非整合策略，非DNA策略，提高iPS細胞的建系效率等幾個方面著重介紹了建立iPS細胞的新方法。

1 重編程基因的刪除策略

利用Cre-loxp和Piggy Bac(PB)系統可以從iPS細胞的遺傳插入位點中移除外源重編程因子。Soldner等人在含有重編程基因的慢病毒載體兩端加上loxp位點，隨后載體整合進入成纖維細胞基因組中。重編程發生后，利用Cre基因的瞬時表達從iPS細胞中移除重編程因子。這種慢病毒載體系統用于建立人iPS細胞系。移除了重編程因子的iPS細胞的基因表達譜與hESC更為接近。Cre介導的重編程基因刪除具有高效，精確的優點，但是iPS基因組中仍保留一個loxp位點和一段載體DNA片段，可能引起插入突變。

PB轉座子可精確地切除自身及外源DNA，并且不會在重編程細胞的基因組中留下任何“痕跡”。Woltjen等人將重編程因子插入PB轉座子的5’和3’末端重復序列之間，在轉座酶的作用下，PB轉座子整合進入成纖維細胞基因組。重編程后，PB轉座酶瞬時表達切除了PB轉座子，在整合位點并未留下任何“痕跡”。通過PB轉座系統產生人iPS細胞的操作類似，但由于轉座效率低，產生的iPS細胞拷貝數較鼠中相對較低。除此以外，PB重編程系統較傳統逆轉錄病毒方法產生iPS細胞的效率更高，也更安全，便于應用。

2 非整合策略

Stadtfeld等人將攜帶有重編程因子的腺病毒載體導入肝細胞，iPS細胞的產生效率達到0.0005℅。Okita等人利用環狀質粒載體的轉染這一過程的穩定整合效率低達1-0.01℅這一優點，在重編程因子表達的8-12天中，隨著重復轉染次數增加，質粒隨機丟失。盡管誘導效率很低，這些結論首次證明了轉基因插入對重編程過程不是必須的。需要指出的是，這些方法均未被應用于產生人iPS細胞，在此過程中沒有外源因子的整合。含有EBNA-1表達盒和orip序列的質粒在細胞核中維持較低拷貝數，在靈長類動物細胞中，每周期復制一次。在篩選壓力下，1%被轉染細胞中質粒以附加體形式存在。不存在篩選壓力的情況下，質粒則以每細胞周期5%的速率丟失。從利用29種不同的附加體質粒的組合所進行的大量實驗中，包括了Oct4，Sox2，Nanog，Lin28，Klf4，c-Myc和SV40大T抗原的三種組合均首次未經過遺傳操作成功地產生了人iPS細胞。

3 非DNA策略

盡管某些小分子成功取代了轉錄因子的作用，蛋白轉導是首個能完全取代基因傳遞的策略。Zhou等人純化了Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc蛋白，這些蛋白包含了聚精氨酸肽標簽，在培養集中可允許重組重編程蛋白通過質膜。在加入了組蛋白去乙酰基酶抑制劑和2-丙基戊酸(VPA)后，經過4輪蛋白補充和23-28天的連續培養，從5€?04個MEF中成功產生了3個iPS克隆。目前仍不清楚是否蛋白轉導也可被用于成年細胞，這一過程比新生細胞或胚胎細胞的重編程更加困難。然而，蛋白轉導避免了從基因水平上篩選iPS細胞和常規的染色體核型分析。

4 提高iPS細胞的建系效率

低建系效率一直是建立iPS細胞的主要障礙，通常只有0.01-0.2℅。若減少轉錄因子的導入，或不使用逆轉錄病毒或慢病毒作為載體，其效率更低。最近，幾個研究小組的報道稱敲除P53基因可將重編程效率提高10%。從提高建系效率方面考慮，這項發現是建立iPS細胞技術的又一偉大進步。然而，嚴謹地說，誘導iPS細胞的四個轉錄因子均可被劃分為癌基因。眾所周知，c-Myc是一種原癌基因;在人乳腺癌干細胞和膀胱癌細胞中均發現Oct4基因過表達。此外，在人胃癌細胞中檢測到Sox2基因的表達，Klf4與許多種癌細胞的形成過程相關。P53 基因是腫瘤抑制基因，它可校核重編程過程，并通過細胞衰老與凋亡機制抑制癌細胞形成。若將其剔除，腫瘤形成的風險大大提高。目前，iPS細胞和癌細胞的關系仍不清楚。尋找提高iPS細胞建系效率的方法，仍是iPS細胞研究的主要任務之一。

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5 結論

利用逆轉錄病毒轉染與小分子物質及候補的起始細胞類型結合的方法，誘導效率已經被提高至100倍。許多新的不利用遺傳修飾的策略也被用于建立iPS細胞。然而這些策略的成功多基于哺乳動物實驗。為了實現在人類細胞中的應用，這些方法的效率仍有待提高。同時，iPS細胞的致癌性，建系的低效性，以及逃避了自然選擇而引起的一系列問題，仍需要進一步研究。目前，iPS細胞形成機理還不清楚，在應用于臨床治療之前，這些問題均有待解決。

參考文獻

[1]Takahashi， K. and Yamanaka， S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126， 663–676.

[2]Soldner F， Hockemeyer D， Beard C， Gao Q， Bell GW， Cook EG， Hargus G， Blak A， Cooper O， Mitalipova M et al.: Parkinson’s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell 2009， 136:964-977.

[3]Woltjen K， Michael IP， Mohseni P， Desai R， Mileikovsky M，Hamalainen R， Cowling R， Wang W， Liu P， Gertsenstein M et al.:Piggy Bac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature 2009， 458:766-770.

[4]Stadtfeld M， Nagaya M， Utikal J，Weir G， Hochedlinger K: Induced pluripotent stem cells generated without viral integration.Science 2008， 322:945-949.

[5]Okita K， Nakagawa M， Hyenjong H， Ichisaka T， Yamanaka S:Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science 2008， 322:949-953.