靈芝提取物質量的研究

摘要：目的：對靈芝提取物質量進行了研究。方法：采用薄層色譜法，對靈芝提取物中靈芝有效成分進行了薄層定性鑒別；采用了紫外可見分光光度法對其中的靈芝多糖進行了含量測定。靈芝多糖在波長為625nm處有最大吸收。結果：靈芝多糖在0.0025～0.0125 mg/ul間線性關系良好，r=0.9963，平均回收率為99.80﹪，RSD為2.13﹪。在TLC圖譜中可檢出靈芝的特征斑點。結論：本法操作簡便、準確、重現性好，能夠控制靈芝提取物質量。

關鍵詞：靈芝 提取物 薄層色譜法 紫外可見分光光度法

Ganoderma lucidum extract quantity research

Lin Juandan

Abstract:Objective :Has conducted the research to the ganoderma lucidum extract quantity. Methods :Uses the thin layer chromatography，has carried on the thin layer qualitative distinction to in the ganoderma lucidum extraction ganoderma lucidum effective component; Used the ultraviolet obvious spectrophotometric method to carry on the content determination to ganoderma lucidum polysaccharide.The ganoderma lucidum polysaccharide is 625nm place has the biggest absorption in the wave length. Results :The ganoderma lucidum polysaccharide the linear relations is good in during 0.0025~0.0125 mg/ul，r=0.9963，the average returns-ratio is 99.80 ﹪，RSD is 2.13 ﹪.May pick out the ganoderma lucidum in the TLC atlas the characteristic spot. Conclusion :This law operation simple，accurate，the reproduction quality is good，can control the ganoderma lucidum extract quantity.

Keywords :Ganoderma lucidum Extraction Thin layer chromatography Ultraviolet obvious spectrophotometric method

【中圖分類號】R91 【文獻標識碼】A 【文章編號】1008-1879(2010)12-0004-03

靈芝提取物是將靈芝藥材按優選出的提取工藝水提濃縮，噴霧干燥，干法制粒所得到的顆粒，為了規范藥品質量，保證臨床療效，建立了靈芝提取物質量標準。

靈芝是一類大型真菌，屬于擔子菌類多孔菌科靈芝屬。自20世紀70年代起，中國、日本、韓國等國都靈芝子實體、孢子粉和菌絲體等進行了比較全面系統的研究，開展了菌類分類、栽培、發酵培養、化學、藥理和臨床等研究工作。之后。東南亞、印度尼西亞、新加坡、加拿大、法國、美國等國學者對靈芝也給予極大的關注。近十年來，中外學者對靈芝子實體、菌絲體、孢子粉和發酵液及不同方法提取的有效成分進行了廣泛深入的研究，研究水平已從整體器官水平深入到分子水平，并對靈芝扶正固本的機理進行了深入的探討。

靈芝多糖是能夠控制細胞分裂分化，調節細胞生長衰老的一類活性多糖，具有抗腫瘤、抗病毒、護肝、排毒、提高免疫力等多種生物活性。有文獻表明，對于含有靈芝多糖的藥材中靈芝多糖的提取采用少量多次的水醇法，但含醇量應控制在80%以上［1］。水提醇沉法提取靈芝多糖的最佳工藝條件為提取時間為3小時，次數為4，溫度為80℃，料液比為1:5，乙醇濃度為95%。具有良好的重復性［2］。靈芝多糖提取優化工藝（加鹽水提取，加入乙酸中和除鹽或超濾除鹽）及超聲，可提高多糖得率iii。靈芝多糖作為一種生物非特異性免疫促進劑，現正為研究者所關注。所以在提取分析時，以靈芝多糖作為含量測定的對象。

1 儀器與材料

1．1 試藥。蒽酮（上海化學試劑采購供應站經銷批號：225） 96%濃硫酸 無水葡萄糖對照品（汕頭市光華化學廠批號：20000216）無水乙醇（分析純）水（為雙蒸水）靈芝［五批：（第一批：廣東深圳一致藥業批號20070201 第二批：山東 家種第三批：東北家種第四批：廣西 野生第五批：東北野生）］

1．2 儀器。島津UV-2201型紫外分光光度儀 METTLER AE200型電子天平 薄層層析用硅膠G板（青島海洋化工分廠）電熱恒溫水浴鍋（北京市長風儀器儀表公司型號：HH.SY21-Ni）離心機（上海安享科學儀器廠制造） 全自動高速冷凍離心機（湘西儀器儀表總廠科學儀器廠型號：GL20A）KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）蘇泊爾微電腦電磁爐（浙江蘇泊爾炊具股份有限公司型號：C19S01-A0） 薄層數碼成像系統（型號：022.9610） 真空干燥箱（常州制藥化工機械總廠有限公司）

2 方法與結果

2．1 藥材檢驗（按2005年版中國藥典）。

2．1．1 定性鑒別。

2．1．1．1 供試品溶液制備:取上述五批靈芝藥材各2g，加乙醇30ml，加熱回流30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2ml溶解，作為供試品溶液。

2．1．1．2 對照品溶液制備：另取靈芝對照藥材2g，同供試品溶液制備法制成對照藥材溶液。

2．1．1．3 薄層層析：吸取供試品和對照藥材溶液各5ul，分別點于同一硅膠板上，以石油醚（60～90℃）～乙酸乙酯～甲酸（15∶5∶1）為展開劑，取出，晾干。置紫外燈（365nm）下檢視。在供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

2．2 藥材的含量測定（按2005年版中國藥典）。

2．2．1 供試品溶液的制備：取本品粉末約2g，精密稱定，置索氏提取器中，加水90ml，電加熱器加熱回流提取至提取液無色，提取液轉移至100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取10ml，加乙醇150ml，搖勻，4℃放置12小時，取出，離心，傾去上清液，沉淀加水溶解并轉移至50ml量瓶中，加水稀釋到刻度。搖勻，即得。

2．2．2 測定法：精密量取供試品溶液2ml，置10ml具塞試管中，精密加入硫酸蒽酮溶液（精密稱取蒽酮0.1g，加80%的硫酸溶液100ml使溶解，搖勻）6ml，搖勻，置水浴鍋中加熱15分鐘，取出，放入冰水浴冷卻15分鐘，以2ml水加6ml硫酸蒽酮試液作空白，照紫外可見分光光度法［4］，在625nm波長處測定吸光度，在30分鐘內完成。測定結果見表1。

2005年中國藥典第一部中靈芝的含量規定為含靈芝多糖以無水葡萄糖計，不得少于0.50%。測定結果表明，實驗所用的五批靈芝藥材為合格藥材。

2．3 靈芝配方顆粒原料的制備。

2．3．1 靈芝的前處理：挑選上述合格的優質靈芝，將其切成小條狀。

2．3．2 靈芝的煎煮：取靈芝飲片適量，加10倍量水在60℃溫浸1小時，再按煎煮法在常壓下提取二次，分別為10倍量水/25小時，8倍量水/1.5小時，合并煎液，濾過，濾液靜置12小時，取上清液濃縮至相對密度為1.15～1.20的清膏。減壓干燥，制成干清膏。（見表2）

2．3．3 干膏的鑒別：取本品粉末1g，加乙醇30ml，加熱回流30分鐘，濾過，濾液蒸干。殘渣加甲醇2ml使溶解，作為供試品溶液。另取靈芝對照藥材2g，同法制成對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各5ul，分別點于同一硅膠G板上，以石油醚（60～90℃）～乙酸乙酯～甲酸（15∶5∶1）為展開劑，取出，晾干。置紫外燈（365nm）下檢視。在供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

2．3．4 含量測定。

2．3．4．1 供試品溶液的制備：取藥材干清膏約1g，精密稱定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2ml，加入乙醇10ml，搖勻，4℃放置12小時，取出，離心，傾去上清液，沉淀加水溶解并轉移至50ml量瓶中，加水稀釋到刻度，搖勻，即得。

2．3．4．2 對照品溶液的制備：精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖對照品適量，加水制成1ml含0.1mg的溶液，即得。

2．3．4．3 最大吸收波長的確定：精取葡萄糖標準溶液1.0ml，置試管中，加水至2ml，再加硫酸蒽酮6ml，混勻，置水浴中加溫15分鐘，取出，冰浴冷卻15分鐘，加水2ml和6ml硫酸蒽酮作空白對照。在島津UV-2201型分光光度計上，于580～700nm波長范圍內測定吸收度。結果在625nm處有最大吸收，同法測得靈芝藥供試液均在625nm處有最大吸收。見所以選擇625nm波長處測定吸光度。

2．3．4．4 測定法：

2．3．4.4.1 供試品溶液的制備：取本品約2g，精密稱定，置索氏提取器中，加水90ml，電加熱器加熱回流提取至提取液無色，提取液轉移至100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取10ml，加乙醇150ml，搖勻，4℃放置12小時，取出，離心，傾去上清液，沉淀加水溶解并轉移至50ml量瓶中，加水稀釋到刻度。搖勻，即得。

2．3．4.4.2 測定法：精密量取供試品溶液2ml，置10ml具塞試管中，精密加入硫酸蒽酮溶液6ml，搖勻，置水浴鍋中加熱15分鐘，取出，放入冰水浴冷卻15分鐘，以2ml水加6ml硫酸蒽酮試液作空白，照紫外可見分光光度法，在625nm波長處測定吸光度，在30分鐘內完成。結果如表3。

2．4 方法學考察。

2．4．1 線性關系考查：分別精密吸取對照品溶液0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml，置10ml具塞試管中，加水至2.0ml，照藥材含量測定測定法項下的方法，自“精密加入硫酸蒽酮溶液6ml”起，依法測定吸光度。線性關系如圖2：

以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算得：y=35.12x-0.0094r=0.9963.線性范圍：0.0025～0.0125 mg/ul

2．4．2 精密度實驗。

取同一供試品（取第一批制備供試品），重復測定6次，吸光度為0.282，0.282，0.280，0.279，0.279，0.280.RSD=0.49%實驗表明，本方法具有良好的精密度。

2．4．3 穩定性實驗。

取供試品（取第一批制備供試品），隔一段時間測量一次，記錄吸光度。（見 表4）。實驗結果表明，本方法具有良好的穩定性。

2．4．4 重現性實驗。取第一批制備供試品溶液，按樣品含量測定項下方法重復測定5次，分別測定。（見表5）

2．4．5 準確度實驗。

采用加樣回收法。取已知含量的樣品五批（第五批為每1g含60mg的多糖），取0.5g左右，精稱稱定，再精密加入40mg的無水葡萄糖，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。（按含量測定項下方法進行）并按照下式公式計算，結果見表6。