綠色木霉發酵產木聚糖酶的培養條件研究

杜密英蘇 琦杜進民

（1桂林旅游高等專科學校，桂林 541006） （2河北廊坊工商局，廊坊065000） （3河北科技大學，石家莊 050018）

綠色木霉發酵產木聚糖酶的培養條件研究

杜密英1*蘇 琦2杜進民3

（1桂林旅游高等專科學校，桂林 541006） （2河北廊坊工商局，廊坊065000） （3河北科技大學，石家莊 050018）

以玉米芯為主要原料，探索綠色木霉發酵玉米芯產木聚糖酶的培養條件，進一步提高木聚糖酶的酶活。結果表明其產酶最佳培養條件為：接種量為5 mL（孢子1.3×107個/mL），初始pH值為6，玉米芯與水質量比為1∶2，溫度為33℃，在培養到第4 d時，其酶活力最高達1 537.52 U/mL。

綠色木霉；木聚糖酶；培養條件

木聚糖酶是一類重要的木糖苷鍵水解酶，對水解植物中的半纖維素有著重要的作用，特別是利用木聚糖酶酶解可制得雙歧桿菌增殖因子低聚木糖，國際上對木聚糖酶的研究十分重視。以木聚糖為碳源從而有選擇性地生產木聚糖酶在木霉屬和曲霉屬微生物已經獲得了成功。玉米芯含有豐富的木聚糖，疏松適度利于通氣，表面積大，特別適合于好氣性微生物生長。本文以玉米芯為原料，摸索了綠色木霉最適產酶條件，可大大提高綠色木霉產木聚糖酶的酶活。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米芯采集于河北省石家莊市近郊；綠色木霉菌種由河北科技大學生物安全實驗室提供。

1.2 化學試劑和儀器

1.2.1 DNS試劑的配制

A液：182 g酒石酸鉀鈉完全溶于500 mL蒸餾水中；B液：16 g氫氧化鈉完全溶于250 mL蒸餾水中；C液：10 g 3，5-二硝基水楊酸完全溶于B溶液中；DNS試劑：將C液與A液混合，加入5 g苯酚，溶解后用蒸餾水定容至1 000 mL，用棕色瓶放置7 d，用細紗布過濾，避光保存。

1.2.2 Tris-HCl緩沖液的配制

0.1 mol/L鹽酸溶液的配制：量取1 mL濃鹽酸，加蒸餾水定容至100 mL；0.1 mol/L Tris溶液的配制：稱取12.114 g Tris，加蒸餾水定容至1 000 mL；Tris-HCl緩沖液的配制：50 mL 0.1 mol/L Tris溶液，加入40.3 mL 0.1 mol/L HCl溶液，加蒸餾水定容至100 mL。

1.2.3 儀器

VIS-7220可見分光光度計，北京第二光學儀器廠；LRH-150S恒溫恒濕培養箱，廣東省醫療器械廠；LRH-300-GSⅡ微電腦控制人工氣候箱，廣東省醫療器械廠；D-1自動蒸汽滅菌鍋，北京海淀儀器廠；A250生化培養箱，江蘇省金壇市宏華儀器廠。

1.3 綠色木霉的培養

篩選培養基：磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、蛋白胨1 g、瓊脂22 g、濾紙10 g、自然pH值、1 000 mL蒸餾水，滅菌冷卻到50℃后加入1 mL鏈霉素（50萬單位/mL）。

基礎培養基：磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、蛋白胨1 g、瓊脂22 g、濾紙10 g、自然pH值、1 000 mL蒸餾水，滅菌冷卻。

發酵培養基：玉米芯10 g、磷酸二氫鉀0.16 g、硫酸銨0.1 g、豆餅粉0.15 g、蒸餾水100 mL，滅菌冷卻。

將少量土樣用蒸餾水溶解，取2 mL加到篩選培養基中，涂布均勻，置于33℃條件下培養4 d。挑取綠色的菌落，轉接到基礎培養基中，33℃繼續培養4 d。

發酵培養基接入5 mL孢子懸液，攪拌均勻，置于33℃條件下培養6 d。

1.4 制備方法

1.4.1 孢子懸液的制備

以基礎培養基培養的綠色木霉菌株為出發菌株，用無菌生理鹽水洗下平板上的孢子，置于50 mL的三角瓶中，33℃，振蕩30 min，用脫脂棉濾去菌絲片斷，血球計數板計數并調整孢子濃度為1.3×107個 /mL。

1.4.2 孢子濃度的檢測

采用血球計數板對孢子懸液進行計數。

1.4.3 木聚糖酶粗酶液的制備

稱取發酵4d的發酵曲10g，用100mL 0.1mol/L（pH值5.0） 檸檬酸緩沖液于30℃的環境下浸提2 h，過濾，4 000 r/min離心10 min，取濾液，即為木聚糖酶粗酶液。

1.4.4 木聚糖液的制備

玉米芯粉20 g，自來水清洗3次～4次，用去離子水浸泡2 h，紗布過濾取渣，用質量分數10%氫氧化鈉200 mL煮沸60 min，冷卻到室溫，用紗布過濾取濾液，用濃鹽酸中和到pH值為7，4 000 r/min離心10 min，沉淀干燥，得到粗木聚糖。稱取粗木聚糖5 g，100 mL去離子水溶解，得到粗木聚糖液。

1.5 測定方法

1.5.1 還原糖含量的測定

取木聚糖液0.5 mL，空白用去離子水，用Tris-HCl補至2.0 mL，加入DNS試劑1.5 mL，于沸水浴中加熱反應5 min，冷卻，搖勻，過濾，取濾液，于540 nm處測吸光度，根據回歸方程求得還原糖的含量。

標準曲線的繪制：準確稱取干燥的木糖2.0 g，加去離子水溶解，定容至100 mL，此為標準木糖溶液，質量濃度為2 mg/mL。分別取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL標準木糖溶液，加到10 mL試管中。每個試管中加Tris-HCl補至2 mL，再各加DNS試劑1.5 mL，充分混勻后，于沸水浴中加熱反應5 min，然后迅速用冷水將其冷卻至室溫，搖勻，于540 nm處測吸光度。以吸光度為橫坐標，木糖質量濃度為縱坐標，繪制標準曲線，如圖1所示。注意，每個測定值都要有重復。每重新配置一次DNS，必須重新做一條標準曲線。

圖1 還原糖-吸光度標準曲線

1.5.2 木聚糖酶酶活的測定

木聚糖酶在一定條件下水解木聚糖，釋放出還原糖（以木糖計算） 與3,5-二硝基水楊酸（DNS）反應，產生顏色變化，這種顏色變化與釋放的還原性糖（以木糖計算）的量成正比關系，即與酶樣品中的酶活性成正比。通過在540 nm的光吸收值查對標準曲線（以木糖為標準物）可以確定還原糖產生的量，從而確定出酶的活力單位。

參照參考文獻［5］G.L.Miller等的法具體操作如下：

取經過適當稀釋的粗酶液0.5 mL，加入2.0 mL木聚糖液，55℃條件下準確反應10 min之后，加入1.5 mL DNS試劑，充分混合均勻后，于沸水中煮沸5 min，取出，迅速用冷水將其冷卻至室溫，最后在540 nm吸光度下測定吸光度值，以空白對照調零。

空白對照：取經100℃滅活適當稀釋的粗酶液0.5 mL，加入2.0 mL木聚糖液，55℃條件下準確反應10 min后，加入1.5 mL DNS試劑，充分混勻后，于沸水中煮沸5 min，迅速用冷水將其冷卻至室溫，最后在540 nm下測定吸光度值。

酶活力單位定義為：試驗條件下每分鐘水解木聚糖形成相當1 μg木糖的還原糖所需的酶量，計算公式如下：

式中：N——酶液稀釋倍數；

G——酶解溶液中木糖的含量，μg；

0.5——吸取的酶液體積，mL；

10——酶解時間，min。

1.6 綠色木霉發酵產木聚糖酶條件的優化試驗

1.6.1 最適氮源的選擇

采用發酵培養基，其中的氮源分別為硫酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、玉米漿，經高溫滅菌后，冷卻，將孢子懸液分別接種到4種培養基中，在33℃下培養6 d，然后測定木聚糖酶酶活。

1.6.2 最適接種量的選擇

采用發酵培養基，接種量分別為3 mL、5 mL、10 mL、15 mL，在33℃下培養6 d，然后測定木聚糖酶酶活。

1.6.3 最適pH值的選擇

采用發酵培養基，其中的pH值分別為4、5、6、7，經高溫滅菌后，冷卻，將孢子懸液分別接種到4種培養基中，在33℃下培養6 d，然后測定木聚糖酶酶活。

1.6.4 最適玉米芯與水質量比的選擇

玉米芯與水按質量比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4分別制成4種培養基，經高溫滅菌后，冷卻，將孢子懸液分別接種到培養基中，在33℃下培養6 d，然后測定木聚糖酶酶活。

1.6.5 最適溫度的選擇

采用發酵培養基，經高溫滅菌后，冷卻，將孢子懸液分別接種到培養基中，分別在23℃、28℃、33℃、38℃、43℃下培養6 d，然后測定木聚糖酶酶活。

2 結果與分析

2.1 最適氮源的選擇

豆餅粉作為綠色木霉產木聚糖酶的氮源，含有促綠色木霉產木聚糖酶的生長因子，而且便宜易得，因此在選擇氮源時，每種培養基中都添加豆餅粉。按照1.6.1的試驗條件進行，每天測定綠色木霉產木聚糖酶酶活。氮源對綠色木霉產木聚糖酶的影響如圖2所示。

圖2 氮源對綠色木霉產木聚糖酶的影響

從圖2可以看出：氮源對綠色木霉產木聚糖酶的影響較大。在4種氮源中，玉米漿促進綠色木霉產木聚糖酶的效果明顯高于其他的氮源，可能是因為玉米漿含有豐富的營養物質，例如蛋白質、氨基酸和多種維生素等，而這些物質又是綠色木霉合成木聚糖酶所必需的，更有利于木聚糖酶的合成。當培養到第4 d時，木聚糖酶酶活達到最高。隨著時間的延長，酶活降低，這可能是氮源逐漸減少，營養不足而不利于木聚糖酶的合成。

2.2 最適接種量的選擇

接種量的大小對微生物生長周期有一定的影響，不同的微生物因其生理特性不同以及不同的生長時期，接種量各不相同。本試驗選用3 mL、5 mL、10 mL、15 mL不同體積的孢子懸液（孢子的濃度為1.3×107個/mL） 接種到發酵培養基中進行培養，以研究最適接種量。接種量對綠色木霉產木聚糖酶的影響如圖3所示。

從圖3可以看出：在培養過程中，酶活均呈現出先升高后下降的趨勢，在培養4 d之后，均達到產酶高峰，并且此時5 mL接種量的酶活高于其他3種接種量，因此，以5 mL的接種量為最佳。接種量過低，菌體生長緩慢，發酵延遲，導致產酶量不高；接種量過高，發酵周期短，但是在生成大量酶的同時也受到代謝產物的阻遏作用，從而影響酶的產量。

圖3 接種量對綠色木霉產木聚糖酶的影響

2.3 最適pH值的選擇

培養基的初始pH值對木聚糖酶的合成有重要的影響，pH值不僅影響細胞膜所帶電荷，引起細胞對營養物質吸收狀況變化，而且可以通過改變培養基中有機化合物分子進入細胞狀況，而促進或者抑制微生物的生長。因此，培養初期以及培養過程中pH值直接影響微生物的生長和酶的合成。另外，微生物往往能同時產生好多種酶，每一種微生物都有各自最適生長pH值和產酶pH值，可以通過調控培養初期以及培養過程的pH值，來選擇性合成某一種酶。Dokker研究認為里氏木酶QM9414合成木聚糖酶的最適pH值為4～5。Poutanen認為里氏木酶QM9414合成木聚糖酶的最適pH值為5.2，β-木糖苷酶的最適pH值為4.0。Bailoy等人在研究里氏木酶RutC-30合成木聚糖酶時發現，在培養過程中維持較高pH值能抑制維素酶的合成，提高木聚糖酶酶活和纖維素酶活的比值。劉超綱的研究也得到類似的結論。這對通過人工調控提高木霉選擇性合成木聚糖的能力具有指導意義。

本試驗通過改變發酵培養基的初始pH值來研究pH值對綠色木霉產木聚糖酶的影響。調節pH值分別為4、5、6、7，培養6 d。pH值對綠色木霉產木聚糖酶的影響如圖4所示。

從圖4可以看出，培養基的初始pH值不同，綠色木霉產木聚糖酶的酶活性明顯不同。在pH值達到6之前，隨著pH值的增大，木聚糖酶的酶活性逐漸升高；pH值為6時，木聚糖酶的酶活性最高，且在pH值5～6這個范圍內，木聚糖酶的活性比較穩定；pH值大于6之后，木聚糖酶酶活隨著pH值的增大而降低。因此培養基的初始pH值為6時，對于綠色木霉產木聚糖酶是最有利的。究其原因，可能是pH值為6時，能夠有效地的影響細胞膜所帶的電荷，使培養基中的有機化合物分子很容易地進入細胞，從而促進細胞對營養物質的吸收，加快酶的合成。

圖4 pH值對綠色木霉產木聚糖酶的影響

2.4 最適玉米芯與水質量比的選擇

固態發酵是指不溶性的底物在足夠的濕度但沒有游離水的狀態下被微生物所發酵的過程。在固態發酵的過程中，底物的含水量是一個非常重要的工藝參數。本試驗采用玉米芯為碳源，調整玉米芯與水質量的比例分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，來研究玉米芯與水質量比對綠色木霉產木聚糖酶的影響，結果如圖5。

圖5 玉米芯與水質量比對綠色木霉產木聚糖酶的影響

圖5顯示，玉米芯與水質量比為1∶2、培養4 d時的酶活最高，可能是培養基質中適當的含水量能確保菌體良好的生長。含水量過低，不利于營養物質溶解與傳遞，菌株孢子萌發緩慢，產酶量低；含水量過高，使培養基表面粘連，導致培養基中容氧量不足和發酵熱散失，而造成發酵不徹底。

2.5 最適溫度的選擇

溫度是發酵培養過程中重要的參數之一，控制好溫度可以減少其他酶的產生和分泌，提高木聚糖酶產量。據文獻［14］報道，微生物發酵最適菌體生長溫度與最適代謝產物合成溫度往往存在差異。因此，有必要選擇一個合適的發酵溫度以保證菌體生長與產物合成的順利進行。本試驗研究了不同溫度對綠色木霉產木聚糖酶的影響，結果如圖6所示。

圖6 溫度對綠色木霉產木聚糖酶的影響

圖6 溫度對綠色木霉產木聚糖酶的影響

圖6顯示，木聚糖酶酶活性的變化規律具有一般酶的共性。隨著溫度升高，木聚糖酶活性上升，峰值出現在33℃，此時木聚糖酶酶活達到1 537.52 U/mL；之后隨著溫度的升高，活性開始下降，到43℃，幾乎和23℃的酶活一致。當培養溫度控制在33℃時，綠色木霉誘導合成木聚糖酶的水平較高，酶活達到1 537.52 U/mL，這與吳克等在木霉菌株T6木聚糖酶固態發酵條件和酶學性質研究結果有所不同。當溫度低于28℃，不利于菌體生長，雜菌容易生長，易造成污染。當溫度高于38℃，基質容易變干，甚至出現燒曲的現象。

由圖6還可以看出，在氮源、玉米芯和水質量比、pH值和溫度等培養條件都進行優化后，在第4 d酶活達到最高。這是因為固體培養基在高溫滅菌時，有部分多糖水解，所以發酵開始時，基質中含有較高濃度的殘留還原糖，這為細胞的快速生長提供了可快速吸收的營養物質。由于木聚糖酶系誘導酶，酶的合成會受到容易利用碳源的阻礙，加之發酵開始階段的生物量較少，所以酶活力較低，至發酵第4 d時，木聚糖酶活力達高峰。培養第5 d，酶活力下降，所以此菌株固體發酵以4 d為宜。

3 結論

優化了綠色木霉產木聚糖酶的培養條件，主要對于接種量、初始pH值、固液質量比、溫度等條件進行了研究。結果表明，產酶最佳培養條件為：接種量為5 mL（孢子1.3×107個/mL），初始pH值為6，玉米芯與水質量比為1∶2，溫度為33℃，在培養到第4 d時，其酶活力最高達1 537.52 U/mL。

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Effect ofculture conditions on xylanase activity produced from trichoderma

DUMi-ying1*SUQi2DUJin-min3
1（Guilin institute oftourism，Guilin 541006，China）2（Langfangbureau ofindustryand commerce，Langfang 065000，China）3（Hebei universityofscience and technology，Shijiazhuang 050018，China）

The cultivation conditions were discussed.The most suitable carbon source in the culture media should be corncob，the most suitable nitrogen source was the corn thick liquid，the quantity of the inoculation should be 5 mL（1.3×107spores/mL），the initial pH value is 6，the proportion of the solid and liquid wais 1∶2，the temperature was 33℃，the time was 96 h.In these conditions could the enzymatic activityreach to1537.52 U/mL.

trichoderma viride；xylanase；cultivation condition

TS261.1+5

A

1673-6004（2011）04-0056-04

* 杜密英，女，1978年出生，2007年畢業于河北科技大學食品科學專業，碩士，助教。

2011-10-11