米曲霉菌種選育的研究進(jìn)展

李 晶 馬貴民

（黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院食品生物系，哈爾濱 150025）

米曲霉菌種選育的研究進(jìn)展

李 晶*馬貴民

（黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院食品生物系，哈爾濱 150025）

介紹了誘變育種、原生質(zhì)體融合及基因工程技術(shù)在米曲霉茵種選育中的應(yīng)用及研究進(jìn)展。

米曲霉；誘變育種；原生質(zhì)體融合

米曲霉（Aspergillus oryzae）是發(fā)酵工業(yè)常用的生產(chǎn)菌種，分類上歸屬于半知菌亞門，是曲霉屬真菌中的一個常見種，該菌株酶系廣泛，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、果膠酶、纖維素酶、植酸酶等，可被廣泛應(yīng)用于釀造酒、調(diào)味品和飼料生產(chǎn)等發(fā)酵工業(yè)，并已被安全地應(yīng)用了1 000多年。然而在發(fā)酵生產(chǎn)過程中，由于長期的移種和保藏，菌種會出現(xiàn)退化，導(dǎo)致米曲霉酶活性和代謝能力降低，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此，菌種選育工作就顯得十分重要了。近年來國內(nèi)外育種工作者們利用不同的育種方法對米曲霉菌種進(jìn)行定向改良，優(yōu)化菌種資源，并已取得了顯著的成績。

1 米曲霉誘變育種的研究

誘變育種是當(dāng)前菌種選育的一種主要方法，在生產(chǎn)實(shí)踐中使用的十分普遍。誘變育種和其他育種方法相比，具有明顯的優(yōu)勢，操作速度快、收益大、方法簡單，但是誘變育種缺乏定向性，因此誘變突變必須與大規(guī)模的篩選工作相配合才能收到良好的效果。目前，誘變育種仍然是米曲霉菌種選育的主要方法。

米曲霉的誘變育種一般采用對細(xì)胞或原生質(zhì)體進(jìn)行物理及化學(xué)誘變，來篩選出高產(chǎn)各種酶類的菌株，我國開展這項(xiàng)育種工作已有50多年的時間了，許多研究機(jī)構(gòu)在這方面都做了大量的工作，并取得了可喜的成績。目前國內(nèi)大部分釀造廠一直沿用至今的滬釀3.042米曲霉是林祖申先生在20世紀(jì)60年代用紫外線誘變和高蛋白質(zhì)馴養(yǎng)選育出的，該菌株具有生長快、孢子多，制曲管理容易等優(yōu)點(diǎn)，頗受生產(chǎn)單位歡迎。為了進(jìn)一步提高原料利用率，降低生產(chǎn)成本，林祖申先生以瀘釀3.042米曲霉為出發(fā)菌株，采用快中子、鈷60γ-射線、紫外線、甲基磺酸乙酯（EMS）、氯化鋰等交替誘變育種，篩選出了UE336-2新菌種，并測得中性蛋白酶活力比對照菌提高1倍以上，將其應(yīng)用于醬油生產(chǎn)，原料全氮利用率可提高7.3%。

在近十年時間里，米曲霉的誘變育種工作也取得了顯著成績。周其洋以米曲霉1-7.3為出發(fā)菌株,經(jīng)過紫外誘變、初篩得到生長速度快、孢子顏色和菌落形態(tài)發(fā)生變化的菌株125株，再經(jīng)過制曲復(fù)篩進(jìn)一步得到了一株綜合酶系優(yōu)良的目標(biāo)菌株80 110，該菌株在多種酶系的活力上都有明顯的提高。邵偉等以滬釀3.042為出發(fā)菌株，經(jīng)對其孢子進(jìn)行紫外線和硫酸二乙酯復(fù)合誘變，經(jīng)溫度選擇培養(yǎng)，得到一株變異菌株A11。該菌株在45℃條件下仍能生長發(fā)育，且蛋白酶活性高，有較好的遺傳穩(wěn)定性。郭繼平等以從自然發(fā)酵黃豆醬中篩選的5株野生米曲霉為供試菌株，篩選出米曲霉K61作為誘變出發(fā)菌株，采用紫外誘變對米曲霉K61菌株進(jìn)行改造，篩選出一株蛋白酶活力高且遺傳性能穩(wěn)定的突變株Y29。該菌株應(yīng)用于黃豆醬的生產(chǎn)中，蛋白酶活力明顯高于米曲霉滬釀3.042菌株，且米曲霉Y29的醬香更濃郁一些，氨基酸態(tài)氮含量也高于米曲霉滬釀3.042菌株。馬瓊以米曲霉作為原始菌株，經(jīng)硫酸二乙酯（DES）、紫外線照射復(fù)合誘變，得到一株高產(chǎn)纖維素酶的突變菌株Ⅱ5，其纖維素酶活力高達(dá)100.23 U/100mL，為出發(fā)菌株的1.39倍。

隨著研究方法的不斷深入，新的誘變育種方法也在得到不斷地嘗試。鄧靜等以去壁米曲霉孢子為誘變對象，采用Licl2微波、DES2超聲波復(fù)合誘變，最終選出1株高產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株C2，其產(chǎn)酸性蛋白酶活力是原始菌株的135.0%。王華等以米曲霉3.042一級菌種為出發(fā)菌株，采用不同壓力梯度處理米曲霉孢子懸液，篩選獲得了一株可穩(wěn)定遺傳的HP300a理想變異菌株，這是高壓誘變法在米曲霉菌種選育中的首次嘗試，他不僅為高壓誘變篩選米曲霉優(yōu)良菌種提供了一定的理論依據(jù)，而且也為運(yùn)用高壓技術(shù)誘變菌種這一新的領(lǐng)域提供了理論依據(jù)。離子注入誘變育種技術(shù)是近些年發(fā)展起來的物理誘變技術(shù)，作為一項(xiàng)微生物新型誘變方法已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用并且取得了相當(dāng)?shù)某删汀２苄〖t等選用N＋離子注入的方法對3.042米曲霉進(jìn)行誘變育種，篩選得到蛋白酶活力有所提高的突變菌種TK-7，該菌株在三角瓶曲的蛋白酶活和原菌株相比提高了36%，誘變試驗(yàn)效果顯著。

國外科研人員對米曲霉的誘變育種研究的也很多，如井口氏對米曲霉生產(chǎn)菌種曾進(jìn)行過Χ線照射誘變，得到蛋白酶活力比原出發(fā)菌株高2倍的X-816菌株，那須野氏再次誘變，把X-816的蛋白酶活提高到6倍，所得到的變異株與原出發(fā)菌株的酶系統(tǒng)沒有改變。Biesebeke等對米曲霉進(jìn)行誘變育種，結(jié)果表明，突變后菌株產(chǎn)淀粉酶活力提高50%，葡萄糖化酶活力提高近100%，蛋白酶活力提高90%。

2 原生質(zhì)體融合技術(shù)在米曲霉菌種選育中的應(yīng)用

自1974年匈牙利的FerenczyL等采用離心力誘導(dǎo)的方法，首次報道了白地霉?fàn)I養(yǎng)缺陷型突變株的原生質(zhì)體融合方法以后，原生質(zhì)體融合技術(shù)就成為了微生物育種的一項(xiàng)新技術(shù)。米曲霉是食品釀造工業(yè)中的重要微生物，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育優(yōu)良米曲霉菌株一直是國內(nèi)外育種工作者研究的熱點(diǎn)問題。

我國米曲霉原生質(zhì)體融合技術(shù)研究開始于20世紀(jì)80年代，邢來君等人首先對米曲霉原生質(zhì)體的制備和再生條件進(jìn)行了研究，隨后對米曲霉進(jìn)行了原生質(zhì)體的營養(yǎng)互補(bǔ)融合，成功獲得了融合子，融合頻率為0.24%～0.47%。20世紀(jì)90年代，辛明秀等采用混合酶液處理米曲霉3.042營養(yǎng)缺陷型菌絲獲得原生質(zhì)體，以PEG為融合劑進(jìn)行融合處理，成功地獲得米曲霉原生質(zhì)體的營養(yǎng)互補(bǔ)融合。早期的米曲霉原生質(zhì)體融合技術(shù)均采用的是營養(yǎng)缺陷型親本，但是營養(yǎng)缺陷型親本菌株遺傳標(biāo)記的誘變篩選既費(fèi)時又費(fèi)力，而且會帶來一些不良突變。近10年里，育種工作者們在米曲霉的融合方法上做了大量的研究，普遍采用雙親滅活原生質(zhì)體融合的方法，彌補(bǔ)了不足，并取得了可喜的成績。唐潔等對米曲霉CICC2339和米曲霉AS3.951菌株的原生質(zhì)體分別進(jìn)行了微波和紫外滅活，然后在融合劑的作用下對滅活雙親進(jìn)行融合，篩選出3株生長速度快且蛋白酶活力高的融合株。王燕對米曲霉（AS3.951） GIM3.13和CICC2339的原生質(zhì)體分別進(jìn)行熱滅活及紫外滅活，然后對滅活雙親用PEG作融合劑進(jìn)行原生質(zhì)體融合，篩選出來比親本產(chǎn)酶高的融合株。唐潔等人還采用了電誘導(dǎo)融合的方法，成功獲得了融合菌株。日本曾在1983年和1984年分別報道了利用原生質(zhì)體融合技術(shù)改良米曲霉生長特性及蛋白酶活性而進(jìn)行醬油菌種的育種工作。

3 基因工程技術(shù)在米曲霉菌種選育中的應(yīng)用

隨著基因技術(shù)的飛速發(fā)展，人們開始利用基因工程技術(shù)進(jìn)行菌株改造，以獲得更符合生產(chǎn)需要的優(yōu)異菌株。陸健等運(yùn)用PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變對米曲霉來源的木聚糖酶在畢赤酵母中的重組表達(dá)進(jìn)行了研究，獲得1個表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于親本的突變株I156A。X.F.Zheng等人通過構(gòu)建一株由反義RNA表達(dá)而低產(chǎn)絲氨酸羧肽酶的米曲霉突變株，實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)多種蛋白酶的愿望。在醬油生產(chǎn)過程中，羧肽酶和堿性蛋白酶與氨基酸的生成直接相關(guān)，目前這兩種酶的基因已成功克隆并轉(zhuǎn)化，在新構(gòu)建的基因工程菌株中堿性蛋白酶的活力可提高5倍，羧肽酶的活力可大幅度提高13倍。另外醬油制造中和壓榨性有關(guān)的多聚半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶、纖維素酶和果膠酶等的基因均已被克隆，當(dāng)用高纖維素酶活力的轉(zhuǎn)基因米曲霉生產(chǎn)醬油時，可使醬油的產(chǎn)率明顯提高。

日本研究人員在2005年成功破譯了米曲霉的基因組，在基因組已被破譯的微生物中，米曲霉的堿基對數(shù)目是最多的。米曲霉含有大量與蛋白質(zhì)和脂肪分解酶相關(guān)的基因，能夠把蛋白質(zhì)分解成讓釀造食品更具美味的氨基酸。研究人員認(rèn)為，基因組所包含的信息可以用來尋找最適合米曲霉發(fā)酵的條件，這將有助于提高食品釀造業(yè)的生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量，為發(fā)酵食品的生產(chǎn)提供更為有利的依據(jù)。

4 展望

目前米曲霉菌種選育已取得了顯著的成績，許多優(yōu)良的菌種被選育出來并用于國內(nèi)外的工業(yè)化生產(chǎn)。傳統(tǒng)的誘變育種和原生質(zhì)體融合技術(shù)在米曲霉菌種選育上已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，但還存在一些問題，如隨意性較大，缺少定向性。隨著對米曲霉分子生物學(xué)研究的不斷深入，以基因工程技術(shù)為主的多樣化育種方式將會應(yīng)用到米曲霉的選育中，并為高品質(zhì)產(chǎn)品的開發(fā)提供一個嶄新的途徑。

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The research progress ofaspergillus oryzae in strain breeding

LI Jing*MAGui-min
（Department offood biotechnology，Heilongjiangvocational college ofbiologyscience and technology，Harbin 150025，China）

The application and research progress of mutation breeding,protoplast fusion and gene engineering technologies on aspergillus oryzae in strain breedingwere reviewed.

aspergillus oryzae；mutation breeding；protoplast fusion

TS261.+2

A

1673-6004（2011）04-00011-03

* 李晶，女，1978年出生，2004年畢業(yè)于齊齊哈爾大學(xué)遺傳學(xué)專業(yè)，碩士，講師。

2011-11-21