肝癌細胞中IL-18表達及其調控機制的研究

楊賢子 程甜甜 駱志國 蔣 飛 柴海霞

白介素18(IL-18)具有強烈誘導IFN-γ的能力，能夠促進Th1細胞的分化和Th1細胞因子的產生。無活性的IL-18前體(24 kD)需要經過IL-1β轉化酶(ICE，caspase-1)的剪切才能形成有活性的成熟IL-18(18 kD)[1]。IL-18前體還可以通過粒細胞蛋白水解酶(PR-3，proteinase-3)的酶切產生活性。但IL-18前體若被caspase-3剪切則失去生物學活性[2]。近年來研究發現，IL-18通過巨噬細胞、NK細胞和T細胞產生其他抗腫瘤因子，加強機體對腫瘤的免疫力，在抗腫瘤免疫調節中備受關注，在臨床應用中有重要價值。本研究旨在觀察IL-18及其相關的正負調節基因在正常人類肝細胞和肝癌細胞中表達情況，從而進一步闡述IL-18在人類肝癌細胞中的作用機制，為原發性肝癌的基因治療提供新的靶點和理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株

正常人類肝細胞株QSG-7701(來源于一位女性肝癌患者的癌旁組織)，購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。人類原發性肝癌細胞株MHCC97-L和HCCLM3，由武漢大學中南醫院腫瘤防治研究中心免費提供。這3種人類細胞株均培養于含10%胎牛血清(杭州四季青生物公司)、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養液中(GIBCO公司)，培養條件為37℃，體積分數為5%CO2。

1.2 RT-PCR檢測細胞株中IL-18及其正負調節基因mRNA的表達

應用Primer Premier 5.0軟件，設計目的基因和內參照基因GAPDH的PCR反應引物。引物序列和PCR反應條件(表1)，均由上海生工生物工程公司合成。QSG-7701、MHCC97-L和HCCLM3細胞株，均以每瓶2×106個細胞接種于標準的培養瓶中。當細胞處于對數生長期時，按照Trizol試劑(MRCGENE公司)說明書提取細胞總RNA，紫外分光光度法檢測RNA純度和濃度后，按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis成套試劑盒(MBI Fermentas公司)操作合成cDNA。為了確保RNA的提取和逆轉錄的準確性，所有的cDNA都先要與特異性的寡核苷酸引物(1種構成性表達的基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶，GAPDH)一起進行PCR反應。PCR反應液的終體積為50 μl，含cDNA 2 μl、10 pmol/μl寡核苷酸引物各1 μl、10×PCR緩沖液(含Mg2+) 5 μl、dNTP混合液4 μl、DEPC處理水36.75 μl和5 U/μl Taq DNA聚合酶 0.25 μl (TaKaRa公司)。PCR擴增后，取10 μl的擴增產物在EB染色的2%瓊脂糖凝膠中電泳。應用凝膠成像掃描分析系統(MultilmageTM Light Cabinet，美國Alpha Innotech公司)測定所有條帶，應用AlphaEaseTMv5.5軟件，分析所有條帶各自峰面積值，定義為該條帶的吸光度值(OD)，而目的基因mRNA的相對表達量，則用目的基因(T)與內參照基因(C)吸光度值的比率(T/C OD Ratio)表示。實驗重復3次。

表1 引物序列表

F為正向引物；R為反向引物

1.3 統計學分析

應用SPSS 13.0軟件進行統計學處理，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，檢驗標準取α=0.05。數據用均數±標準差(M±SD)表示。

2 結果

人類肝癌細胞株MHCC97-L和HCCLM3中Th1細胞因子IL-18 mRNA表達水平,明顯低于人類肝細胞株QSG-7701，見圖1，且其正調節基因PR-3 mRNA表達水平也一樣，mRNA相對表達量比較同樣存在統計學差異(P<0.01和P<0.001)，見表2。但正調節基因(caspase-1，ICE)和負調節基因(caspase-3)mRNA相對表達量，2種人類肝癌細胞株和人類肝細胞株間比較無統計學差異(表2)。而在2種人類肝癌細胞株間，無論是IL-18還是其正負調節基因mRNA的表達水平，均無統計學差異。

3 討論

我國是原發性肝癌的發病率和死亡率均較高的國家之一。目前原發性肝癌最常用的治療方式是手術、放療和化療以及依據病情不同而進行的綜合治療，然而總的治療效果并不理想。自從1990年首例基因治療開展以來，肝癌的基因治療逐漸成為生物醫學和臨床醫學的研究熱點之一[3]。細胞因子具有直接殺傷腫瘤細胞的能力，通過刺激機體免疫系統產生強烈的免疫應答,增強機體識別腫瘤細胞的能力，以達到高效殺傷效應。因此將細胞因子基因(TNF-α、IL-12等)導入肝癌患者體內以達到抑制和治療腫瘤的治療手段在肝癌的免疫基因治療中有重要地位[4,5]。

IL-18作為Th1細胞因子，主要由單核/巨噬細胞產生的。有活性的成熟IL-18在人類表皮角質細胞和肺/腸上皮細胞中表達豐富[6]。Wang等[7]發現在正常卵巢上皮中表達有活性的IL-18，而在卵巢癌組織與細胞系中缺如，這可能是由于不表達IL-18，或是不共表達ICE。這一類似的現象同樣存在人類結腸癌、頭頸鱗癌以及B淋巴細胞癌中[8]。隨后對人類卵巢癌細胞進一步的研究發現了1種突變IL-18，這種突變的IL-18分子上ICE作用位點N端的4個氨基酸缺失，致使其不能被ICE酶切成熟IL-18，而突變IL-18在正常細胞中并沒有被發現，表明這可能是腫瘤細胞調節IL-18功能的1種機制[9]。

表2 人肝細胞株和2種肝癌細胞株中IL-18及其調節基因mRNA相對表達量

**和***分別為2種肝癌細胞株(MHCC97-L或HCCLM3)與人肝細胞株QSG-7701比較，**為P<0.01，***為P<0.001

圖1 人肝細胞株和2種肝癌細胞株中IL-18及其調節基因表達的RT-PCR結果

Chia等[10]采用免疫組化法，發現肝癌患者癌旁正常肝組織中IL-18表達水平明顯高于肝癌組織。為了進一步的闡明肝癌細胞調節IL-18功能的分子機制，本研究選用1種來源于肝癌患者癌旁組織的正常肝細胞株和2種原發性肝癌細胞株作為研究對象，采用RT-PCR，分別檢測IL-18及其相關正負調節基因mRNA的表達情況。研究結果再次從基因水平上證實了，肝癌癌旁正常肝細胞中IL-18 mRNA表達水平明顯高于肝癌細胞。雖然在IL-18主要的正調節基因ICE和負調節基因caspase-3 mRNA的表達上無明顯統計學差異，但與肝癌細胞株相比，癌旁正常肝細胞株的另一個正調節基因(粒細胞蛋白水解酶，PR-3)mRNA的表達水平較高，這一結果暗示PR-3表達量的減少，可能是導致肝癌細胞IL-18表達缺失的原因之一。

綜上所述，本研究首次發現在粒細胞蛋白水解酶(PR-3)mRNA的表達上，肝癌細胞明顯低于癌旁正常肝細胞，這可能是肝癌細胞調節IL-18功能的重要機制之一。本研究結果也暗示IL-18或PR-3可能為基因治療原發性肝癌提供一個新的潛在的分子靶點。

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