從分化胚胎干細胞中分選血管構建種子細胞的實驗研究

岳偉 曹誼林 張文杰

從分化胚胎干細胞中分選血管構建種子細胞的實驗研究

岳偉 曹誼林 張文杰

目的 本研究主要比較了應用免疫磁珠（MACS）和流式細胞儀（FACS）兩種分選手段，從ES分化細胞中獲得血管平滑肌細胞和內皮細胞的效率。方法 利用MACS和FACS從ES分化細胞中分選出FLK-1陽性細胞，分別在VEGF和PDGF誘導培養下獲得血管平滑肌細胞和血管內皮細胞，運用MACS和FACS進行細胞性質和純度鑒定，并對兩種方法所獲細胞的活力和細胞得率進行比較研究。結果 利用MACS分選獲得的FLK-1陽性細胞經過PDGF誘導培養后可以得到108～109量級和純度超過90%的血管平滑肌細胞，可滿足構建血管的需要，而利用FACS分選難以獲得構建血管肌層所需的大量細胞。利用FACS分選的FLK-1陽性細胞經過VEGF誘導培養后的純度約60%，表達vWF和吸收低密度脂蛋白（Ac-LDL）的血管內皮細胞；而利用MACS從ES細胞中分選獲得的血管內皮細胞純度較低，兩種分選方法獲得的細胞活力無明顯差別。結論 因組織工程血管構建所需要的平滑肌細胞數量巨大，宜選用MACS從ES分化細胞中分選獲得；而血管內皮細胞宜選用FACS分選獲得。

免疫磁珠 流式細胞儀 純化 胚胎干細胞 組織工程

以組織工程技術在體外構建血管，是今后臨床血管缺損修復的發展方向，其中種子細胞的來源至關重要。自體血管或骨髓內皮細胞可以作為構建血管的種子細胞來源[1-4]，但由于采集手術本身產生創傷，而且得到的種子細胞數量有限，體外擴增困難，無法滿足構建血管的需要；通過基因操作來擴增細胞的方法[5]，存在致瘤性等安全隱患。胚胎干細胞（Embryonic stem cell，ES）具有分化的全能性和無限增殖能力[6-7]，為體外構建血管提供了可能，成為具有應用前景的種子細胞來源之一。

小鼠ES細胞經誘導分化后可形成成熟的血管內皮細胞和平滑肌細胞，利用細胞表面標記Flk-1可以將血管內皮細胞和平滑肌細胞的前體細胞從分化的小鼠ES細胞中分離出來[8-10]。本實驗探討利用免疫磁珠（MACS）和流式細胞儀（FACS）從分化ES細胞中分選獲得血管構建所需兩種種子細胞的可行性，為血管構建奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

DMEM和IMDM培養基，PBS緩沖液，胰蛋白酶（Gibco 公司，美國）；胎牛血清（FBS）（Hyclone 公司，美國）；生物素標記的大鼠抗小鼠CD31，生物素標記的大鼠抗小鼠FLK-1，羊抗兔 IgG-FITC，strepavidin-PE（Pharmingen公司，美國）：鼠抗人SM-actin單克隆抗體（Sigma公司，美國），鼠抗人SM-MHC單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）。

1.2 主要儀器

CO2細胞培養箱（Forma公司，美國）；倒置相差顯微鏡（IMT-1型）和熒光倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；培養皿（Falcon 公司，美國）；EPICS ALTRA流式細胞分選儀（Beckman公司，美國）；免疫磁珠（Stem cell公司，加拿大）。

1.3 胚胎干細胞培養及分化

本實驗使用的是R1-ES細胞株，用含有LIF（白血病抑制因子）和處理過的MEF（胎鼠成纖維細胞）作為飼養層來阻止細胞分化。ES細胞選用擬胚體（Embryoid body，EB）分化方式，以（2～3）×104cells/mL的細胞接種于Petri培養皿。

1.4 MACS分選FLK-1陽性細胞

細胞分組：包括1個不加任何抗體的未染色細胞組、1個一抗空白對照組、1個同型對照組、2個單一染色實驗組和1個細胞分選組。一抗分別滴加生物素結合的大鼠抗小鼠FLK-1（1∶200），空白組不加一抗，二抗滴加 Streptavidin-PE（1∶1 500），加入10 μL/mL Mouse FcR Blocker 和 15 μL/mL Sca1PE Labeling Reagent避免非特異結合。抗原抗體結合后，加入100 μL/mL EasySep PE、Selection Cocktail EasySep Magnetic Nanoparticles和Nanoparticles進行FLK-1陽性細胞的分選。二次分選需重復上述步驟。分選結束后用FCAS進行純度鑒定。

1.5 FACS分選FLK-1陽性細胞和分析

細胞分組同MACS分選。一抗分別滴加生物素結合的大鼠抗小鼠FLK-1（1∶200）、生物素結合的大鼠抗小鼠 PECAM1（1∶200）和鼠抗人 SM-actin 單克隆抗體(1∶200)，空白組不加一抗。結合細胞內抗原SM-actin前樣品需要用0.01%Triton破膜1 min。二抗分別滴加 Streptavidin-PE（1∶1 500）和 FITC 抗小鼠IgG（1∶200）。分選過程中及結束后進行純度鑒定，保證分選質量。

1.6 FLK-1陽性細胞向血管平滑肌細胞和內皮細胞的誘導培養

MACS和FACS分選的FLK-1陽性細胞都接種于0.1%白明膠鋪盤的培養皿中。血管內皮細胞的誘導用50 ng/mL VEGF+EGM-2基礎培養液，血管平滑肌細胞的誘導用10 ng/mL PDGF+含10%血清的IMDM。

1.7 血管內皮細胞及血管平滑肌細胞免疫熒光鑒定

將細胞爬片分實驗組（滴加一抗）、空白對照組（未加一抗），并以小鼠成纖維細胞作陰性對照組，以小鼠平滑肌細胞作陽性對照組。一抗分別滴加生物素結合的大鼠抗小鼠 PECAM1（1∶200），兔抗人 vWF（1∶50）、鼠抗人 SM-actin 單克隆抗體 (1∶200)、鼠抗人SM-MHC(1∶100)和鼠抗人 Calponin單克隆抗體(1∶200)，空白組不加一抗滴加PBS；空白組滴加PBS；置濕盒內，4℃冰箱內過夜；分別依據不同一抗滴加不同第二抗體，如 Streptavidin-PE（1∶500）、羊抗鼠 IgG-FITC（1∶200）、羊抗兔 IgG-FITC（1∶200）和FITC 抗小鼠 IgM（1∶200）。Hochest核襯染 30 sec,甘油封片。樣品在Olympus IX50熒光倒置相差顯微鏡觀察結果并拍照。

1.8 統計學處理

數據采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，計量資料的組間比較采用t檢驗，P<0.05認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 MACS與FACS分選的FLK-1陽性細胞得率及細胞增殖能力比較

本實驗中，我們分別運用MACS與FACS將第4天EB細胞的FLK-1陽性細胞（圖1A）分選出來，并進行純度鑒定（圖1B-C）。從分選得率來看，MACS比FACS分選的FLK-1陽性細胞得率低（圖1D），但由于MACS一次可以分選巨量的細胞，即使為獲得高純度細胞經過兩輪，也可以得到108量級的細胞，而總分選時間并不明顯延長。FACS分選時，為了保證細胞分選后有較高的活力，必需控制分選時程在6 h以內。在這個時間范圍內，MACS與FACS分選的FLK-1陽性細胞培養48 h后的增殖能力均無明顯差別（P>0.05）（圖1E）。本結果提示，盡管FACS分選細胞得率較高，但分選細胞總數是有限的，不大適合巨量活力細胞的分選。

2.2 MACS分選FLK-1陽性細胞及誘導分化為血管平滑肌細胞

運用MACS將第4天EB細胞的FLK-1陽性細胞分選出來進行誘導分化，鑒定誘導細胞的平滑肌細胞表型表達情況（圖2A-D），飼養層細胞MEF作為陰性對照，本實驗室分離培養的小鼠主動脈平滑肌細胞作為陽性對照。結果顯示，培養4 d的FLK-1陽性細胞絕大多數都呈 SM α-actin、SMSMC和Calponin陽性，流式細胞定量分析顯示，在有或無PDGF的條件下SM α-actin陽性率都超過90%，但在有PDGF的條件下分化的平滑肌細胞表型維持較好，其陽性率可以接近96%（圖2B）。

FACS分選時，在有PDGF的條件下誘導的平滑肌細胞大多表達SM α-actin、SM-SMC和 Calponin染色（圖2E-H），陽性率 95%左右（圖3A，B），與MACS分選后誘導分化的平滑肌細胞無明顯區別。

2.3 FACS和MACS分選的FLK-1陽性細胞誘導分化為血管內皮細胞

FACS分選的FLK-1陽性細胞（陽性率>90%）種植在有0.1%白明膠鋪盤的培養皿中，4 d后發現細胞數量明顯增多，以聚合方式生長的橢圓形細胞居多。鑒定結果顯示，FACS分選的細胞誘導的CD31陽性率接近60%（圖3D），這些CD31陽性細胞吸收Ac-LDL（圖2E）并表達 vWF（圖2F），具備血管內皮細胞的基本功能。在同樣培養條件下，MACS分選的FLK-1陽性細胞誘導為血管內皮細胞的效率較FACS分選的誘導效率低（圖3A），吸收Ac-LDL的細胞少（圖3B），vWF表達效果也較差（圖3C）。

圖1 MACS與FACS分選的FLK-1陽性細胞得率及細胞增殖能力的比較Fig.1 Comparison of the FLK-1+cell purity and cell proliferation capacity by MACS and FACS sorting

圖2 MACS與FACS分選后血管平滑肌細胞的誘導分化Fig.2 Vascular smooth muscle cells induction sorted by MACS and FACS

圖3 MACS與FACS分選后血管內皮細胞的誘導分化Fig.3 Inducing differentiation of FLK-1 cells to vascular endothelial cells by MACS and FACS

3 討論

構建組織工程化血管的種子細胞主要包括血管內皮細胞和平滑肌細胞，而小鼠ES細胞在體外具有分化的全能性和無限增殖能力，利用細胞表面標記Flk-1可以將血管內皮細胞和平滑肌細胞的前體細胞從分化的小鼠ES細胞中分離出來，進一步通過改善培養條件，經誘導分化后可產生成熟的血管內皮細胞和平滑肌細胞[8-10]。本實驗證實了從ES細胞單一來源可以獲得組織工程血管構建所需要的兩種種子細胞，可利用MACS分選獲得構建血管所需巨量的血管平滑肌細胞，而血管內皮細胞宜選用FACS分選獲得。本研究結果為構建具有正常結構和功能的血管建立了基本條件。

自Choi等[11]首次從小鼠 ES分化 3.0～3.25 d的細胞中找到一種 Flk-1+血管前體細胞（Hemangioblast），并證明它能夠分化為血管內皮細胞和血管壁周細胞以來，目前關于ES細胞向血管細胞誘導分化誘導技術已相對成熟[12-14]。但這些來源的血管細胞增殖能力較有限，為了獲得足夠數量的血管內皮細胞，有研究采取了將ES分化來源的細胞進行基因操作的方法[15-16]，雖然這樣可以獲得大量的血管細胞，但同時這些經過病毒基因轉染細胞有過度增殖的能力，從而可能導致腫瘤的產生。因此，該方法并非由ES細胞獲得血管細胞的最佳選擇。構建組織工程化血管的種子細胞主要包括血管內皮細胞和平滑肌細胞，其中平滑肌細胞對于在組織工程化血管生物力學的維持、血管的改建和重塑中起著決定性的作用，血管構建時細胞需要量巨大。目前常用的獲得上述兩種種子細胞的方法是從正常的動、靜脈中分離獲得，會造成供區血管的損害，并且操作繁瑣。ES細胞在類胚體分化系統內具有強大的增殖能力，并且在適當階段可以分化出較高比例的Flk-1陽性細胞，為體外構建血管所需要大量功能正常的血管內皮和平滑肌細胞提供了可能。本實驗中，利用MACS一次可以大量分選細胞的優勢，我們以Flk-1作為細胞表面標記在類胚體分化階段獲得足夠數量和純度的平滑肌細胞，可以滿足組織工程化血管肌層構建的需要。我們還運用FACS從4 d的EB細胞中分選出來FLK-1陽性細胞進行誘導分化血管平滑肌細胞研究，盡管誘導的細胞具有較高的平滑肌細胞的表型，而依據我們的經驗，利用流式細胞分選時程最好控制在6 h以內，超過這個時間范圍，利用FACS分選后的細胞活力就明顯降低。因此，通過FACS分選細胞數量是有限的，它不適合從ES分化細胞中純化大量血管平滑肌細胞。而血管內皮細胞，因其對于維持血管通暢尤其重要、又最具有活性，對于構建血管所需的的要求很高，而運行平穩的流式細胞分選平臺則可以穩定地獲得較高純度的細胞亞群，分選純度可控。我們的研究結果證實，利用FACS獲得的血管內皮細胞性質陽性率較高，接近60%。因此，從ES分化細胞中獲得血管內皮細胞宜選用了FACS，以提高分選細胞的純度和質量。另外，為了保證細胞分選后有較高的活力，FACS分選時程最好控制在5 h以內，這樣分選出的FLK-1陽性細胞純度和增殖能力都是比較可靠的，后期誘導分化的血管內皮細胞純度也比較穩定，但如果要獲得純度更高的成熟血管內皮細胞則需要改變分選策略，比如利用CD31直接將內皮細胞從類胚體中分選出來。目前為止，尚沒人嘗試過這種純化血管內皮細胞的方法。我們正在對CD31在ES細胞及其類胚體分化過程中的動態表達規律進行系統研究，未來考慮嘗試將ES分化細胞標記CD31后，再利用FACS直接將內皮細胞純化出來用于血管構建。

本實驗系統比較了利用MACS與FACS從ES分化細胞中獲得足夠數量，且功能正常的的血管內皮細胞和平滑肌細胞，通過研究，進一步明確了選用不同手段獲得血管構建所需的不同種子細胞的方案，為下一步構建出有功能活力的血管創造了基本條件。

[1]Shi Q,Rafii S,Wu MH,Evidence for circulating bone marrowderived endothelial cells[J].Blood,1998,92(2):362-367.

[2]McFetridge PS,Daniel JW,Bodamyali T,et al.Preparation of porcine carotid arteries for vascular tissue engineering applications[J].J Biomed Mater Res,2004,70(2):224-234.

[3]Koike N,Fukumura D,Gralla O,et al.Tissue engineering:creation of long-lasting blood vessels[J].Nature,2004,428(6979):138-139.

[4]Kaushal S,Amiel GE,Guleserian KJ,et al.Functional small-diameter neovessels created using endothelial progenitor cells expanded ex vivo[J].Nat Med,2001,7(9):1035-1040.

[5]Stegemann JP,Dey NB,Lincoln TM,et al.Genetic modification of smooth muscle cells to control phenotype and function in vascular tissue engineering[J].Tissue Eng,2004,10(1-2):189-199.

[6]Evans M,Kaufman MH.Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos[J].Nature,1981,292(5819):154-156.

[7]Thomson JA,Itskovitz-Eldor J,Shapiro SS,et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts[J].Science,1998,282(5391):1145-1147.

[8]Yamashita J,Itoh H,Hirashima M,et al.Flk1-positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenitors[J].Nature,2000,408(6808):92-96.

[9]Chung YS,Zhang WJ,Arentson E,et al.Lineage analysis of the hemangioblast as defined by FLK1 and SCL expression[J].Development,2002,129(23):5511-5520.

[10]Ema M,Faloon P,Zhang WJ,et al.Combinatorial effects of Flk1 and Tal1 on vascular and hematopoietic development in the mouse[J].Genes Dev,2003,17(3):380-393.

[11]Choi K,Kennedy M,Kazarov A,et al.A common precursor for hematopoietic and endothelial cells[J].Development,1998,125(4):725-732.

[12]Vittet D,Prandini MH,Berthier R,et al.Embryonic stem cells differentiate in vitro to endothelial cells through successive maturation steps[J].Blood,1996,88(9):3424-3431.

[13]Kaufman DS,Lewis RL,Hanson ET,et al.Functional endothelial cells derived from rhesus monkey embryonic stem cells[J].Blood,2004,103(4):1325-1332.

[14]Levenberg s,Golub JS,Amit M,et al.Endothelial cells derived from human embryonic stem cells[J].PNAS,2002,99(7):4391-4396.

[15]Balconi G,Spagnuolo R,Dejana E.Development of endothelial cell lines from embryonic stem cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20(6):1443-1451.

[16]Marchetti S,Gimond C,Iljin K,et al.Endothelial cells genetically selected from differentiating mouse embryonic stem cells incorporate at sites of neovascularization in vivo[J].J Cell Sci,2002,115(Pt 10):2075-2085.

Purification of Vascular Cells with MACS and FACS for Constructing Vessel from Differentiated Mouse Embryonic Stem Cells

YUE Wei1,2,CAO Yilin1,ZHANG Wenjie1.1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 Time Plastic Surgery Hospital,Shanghai 200021,China.

ZHANG Wenjie(E-mail：wenjieboshi@yahoo.com.cn).

ObjectiveTo compare the efficiency between using FACS and MACS for purification of smooth muscle cells and endothelial cells induced from differentiated mouse embryonic stem cells.MethodsFLK-1+cells were sorted from EBs by FACS and MACS,and were subsequently induced to vascular endothelial cells and smooth muscle cells with PDGF and VEGF respectively.Cells were then characterized by immunefluoresence staining and FACS.ResultsLarge amount of vascular smooth muscle cells could be obtained from FLK-1 positive cells sorted by MACS.Over 90%of these cells were positive for smooth muscle markers,including SM α-actin,SM-SMC and Calponin.However,low output of smooth cells was observed by FACS sorting.Nearly 60%of cells expressed endothelial cell markers CD31 and vWF after VEGF induction of sorted cells by FACS,but low purity of endothelial cells was achieved from MACS sorting.ConclusionLarge quantity of vascular smooth muscle cells with high purity can be obtained by MACS selection of FLK-1+cells from EBs while high quality of vascular endothelial cells could be achieved by FACS sorting.

MACS;FACS;Purification;Embryonic Stem Cells;Tissue Engineering

Q813.1+1

A

1673－0364（2011）01－0001－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.01.001

國家重點基礎研究發展計劃（2005CB522700，2007CB948004，2011CB964704，2010CB944804）； 國家自然科學基金（30571925，30671051）；上海市曙光人才計劃（06SG22）。

200011 上海市 上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科（岳偉，曹誼林，張文杰）；200021 上海市 上海時光整形外科醫院（岳偉）

張文杰（E-mail：wenjieboshi@yahoo.com.cn）。

2010年12月20日；

2011年1月9日）