楊樹中總酚與黃酮類次生代謝產物含量的變化

李春明 李正華 于文喜* 戴偉男

(1.黑龍江省林業科學研究所，哈爾濱 150081；2.黑龍江省林業科學研究院，哈爾濱 150081)

酚類物質為植物體內合成的在結構上含有芳香環酚羥基及其相關衍生物的一大類化合物，是植物次生代謝產物的重要類群。黃酮類化合物是色原烷或色原酮的2-或3-苯基衍生物，是酚類物質中重要的一類。研究表明，植物中的酚類次生代謝產物與植物抵御低溫傷害能力相關[1～2]。

楊樹是我國北方地區的重要造林和綠化樹種，而楊樹凍害也是困擾林業生產和園林綠化的一個重要問題。楊樹含有豐富的酚類次生代謝產物[3]，但酚類物質變化與楊樹抗寒能力的關系卻不明確。

總酚[4～5]和黃酮[6～]含量的測定方法已有較多報道，但同時測定兩類成分的方法鮮見報道。本文利用均勻試驗設計法和超聲波提取法探討了同時測定楊樹中黃酮和總酚含量的方法，并選擇秋冬氣候驟變時期采集樣樹葉片，測定總酚、黃酮含量的變化，初步分析了總酚、黃酮含量與氣溫變化之間的對應關系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料：實驗所用銀中楊(Populusalba×berolinensis)抗凍能力較差，而迎春5號(PopulusבZhonglinSanbei1’)抗凍能力較強，均為哈爾濱市行道樹。從10月23日(2005年)氣溫驟降開始至10月31日葉片全部凋落，每日采集葉片樣品測定總酚、黃酮含量。每個品種選擇3株成樹，每樹每日采集一個枝條，收集同一枝條的所有葉片作為一個樣品，80℃干燥24h后粉碎備用。

儀器：U-2800紫外-可見分光光度計(日本HITACHI公司)；Biofuge 22R高速冷凍離心機(德國Heraeus sepatech公司)；AB104型電子天平(瑞士)；KQ-100DB超聲波儀(江蘇昆山超聲儀器公司)。

試劑：試劑均為分析純，蘆丁購自中國藥品生物制品檢定所，沒食子酸購自Alfa Aesar公司。

1.2 標準溶液的配制

總酚含量測定以沒食子酸為對照品。精密稱取沒食子酸對照品100mg，95%乙醇定容至25mL，搖勻，作為母液備用。黃酮含量測定以蘆丁為對照品。精密稱取蘆丁對照品100mg，95%乙醇定容至25mL，搖勻，作為母液備用。

1.3 標準曲線的繪制

以95%乙醇為溶劑稀釋沒食子酸、蘆丁母液，分別得到沒食子酸濃度為0.062 5，0.125，0.25，0.5，1mg/mL，蘆丁濃度為0.125，0.25，0.5，1，2mg/mL的標準溶液。按照選定的分析測定條件，分別對不同濃度的標準溶液分析，每樣重復測定3次。分別以質量濃度(mg/mL)為X值，吸光度值A為縱坐標進行回歸計算，得總酚(A1，沒食子酸為對照品)、黃酮(A2，蘆丁為對照品)的回歸方程和相關系數分別為：A1=3.5885X2+0.1226，R1=0.9999，線性范圍：0.025～0.4mg/mL；A2=1.099X1+0.0038，R2=0.9996，線性范圍：0.0625～1mg/mL。

1.4 紫外可見分光光度法測定條件

總酚含量測定的顯色方法及測定條件參照Graham的方法[8]，黃酮含量測定的顯色方法及測定條件參照席先蓉方法[9]。

1.5 樣品制備

影響植物中有效成分超聲提取的因素主要有提取溶劑、超聲頻率、提取時間等。本研究選擇了乙醇濃度和提取時間進行了超聲提取楊樹葉片中黃酮和總酚的2因素11水平的均勻設計試驗(表1)，以總酚、黃酮含量為評價指標，探討了同時測定楊樹葉片中總酚和黃酮含量的最佳樣品制備方法。

精密稱取1g楊樹葉片樣品于25mL容量瓶中，按照設計的實驗條件，分別加入不同濃度的乙醇溶液23mL(每個試驗重復3次)，在工作頻率40kHz、功率100W的條件下超聲波提取相應的時間，冷卻至室溫后用相應濃度的乙醇溶液定容至刻度。移取1.5mL上清液2份至離心管中，離心(12 000r/min)10min，分別測定總酚和黃酮提取率。

2 結果與分析

2.1 樣品制備條件的確定

表1均勻設計實驗條件及分析結果

S均勻設計實驗結果見表1。分別以乙醇濃度(X1)提取時間(X2)為自變量，以總酚提取率(Y1)、黃酮提取率(Y2)為因變量，用均勻設計2.0版數據處理軟件對設計結果進行回歸分析，得回歸方程如下：

Y1=12.031234+0.366653X1-0.069874X2

-0.003703X12

Y2=32.581580+0.589014X1-0.282421X2

-0.005724X12+0.002023X1X2

進行各因素對總酚及黃酮提取率影響的逐步回歸模型分析表明，乙醇濃度對總酚及黃酮提取率的影響較大，而提取時間的影響較小。對各試驗條件進行綜合分析，確定了最佳提取條件為50%乙醇超聲波提取5min。

2.2 精密度實驗

精密稱取5份楊樹葉粉于25mL容量瓶中，每份1g，以23mL的50%乙醇為溶劑，超聲波提取5min，冷卻后50%乙醇稀釋至刻度，取1mL離心后在測定總酚和黃酮含量，測得總酚和黃酮吸光度的相對標準偏差(RSD)分別為4.4%和2.57%。

2.3 回收率實驗

精密稱取6份楊樹葉粉，每份0.5g，其中3份分別加入沒食子對照品10mg，另外3份各加入蘆丁對照品20mg，按樣品制備及測定方法進行定量分析，測得總酚加樣回收率和RSD為104.57%和2.26%，黃酮的分別為103.12%和1.92%。

2.4 楊樹葉片總酚、黃酮含量隨氣溫的變化

從10月23日到10月31日，銀中楊、迎春5號葉片的總酚、黃酮含量均隨氣溫的變化而變。從圖1可以看出，總酚、黃酮含量的變化規律在2個樹種中并不一致，而同一樹種中的總酚和黃酮含量卻有相似的變化趨勢。

總體上看，銀中楊葉片的總酚、黃酮含量在此期間變化幅度較小，而且隨著氣溫的升、降而增、減，但在初期(23—27日)反應略有滯后(1d)。迎春5號葉片的總酚、黃酮含量變化幅度相對較大，趨勢則與銀中楊正好相反，即隨著氣溫的升、降而減、增，但也是在初期(23—27日)反應略有滯后(1d)。兩種楊樹葉片的總酚含量基本相當，而黃酮含量卻有差異，10月26日以后采集的樣品中，銀中楊的黃酮含量明顯高于迎春5號(圖1)。

植物體內酚類成分的含量被認為是評價抗寒性能的最佳生化標記之一[10]，經過逆境誘導的植物抗凍性增強，與其酚類成分的變化有較強的對應性[1]。從本文的實驗結果看，在氣溫劇烈變化時，抗凍能力較強的迎春5號葉片中的總酚、黃酮含量能夠應對氣溫變化而有較大幅度的變化，而抗凍能力較差的銀中楊卻不是這樣。看來這兩種楊樹抗凍能力的差異可能與酚類成分含量是否能夠應對氣溫變化作出合適的調整有關，而與酚類成分含量的絕對大小不明顯相關。

3 結論

(1)建立了一種同時測定楊樹中總酚和黃酮含量的方法；運用均勻設計法考查了楊樹中總酚、黃酮的超聲提取條件，最佳提取工藝條件為50%乙醇超聲波提取5min。

(2)2005年10月下旬氣溫變化較劇烈時，用上述方法測定了銀中楊和迎春5號葉片的總酚和黃酮含量的變化。銀中楊葉片的總酚和黃酮含量隨氣溫升、降而增、減，變化幅度較小。迎春5號葉片則不同，在氣溫降低時能迅速(稍有滯后)增加總酚和黃酮含量，并在氣溫升高時回落，變幅較大。

[1]TEKLEMARIAM T A, BLAKE T J. Phenylalanine ammonia-lyase-induced freezing tolerance in jack pine (Pinus banksiana) seedlings treated with low, ambient levels of ultraviolet-B radiation[J].Physiol plantarum, 2004，122:244～253.

[2]HOSHINO T, ODAIRA M, YOSHIDA M, et al. Physiology and biochemical significance of antifreeze substances in plants[J].J Plant Res,1999,112:255～261.

[3]孫麗艷,韓一凡.對云斑天牛有不同抗性的楊樹品種中化學物質的分析[J].林業科學,1995,31(4):338～345.

[4]嚴守雷,王清章,彭光華.藕節中總酚含量的福林法測定[J].華中農業大學學報,2003,22(4):412～414.

[5]金則新,李鈞敏,朱小燕.不同生境夏蠟覆蓋營養器官總酚含量分析[J].安徽農業大學學報,2006,33(4):454～457.

[6]孫墨瓏,宋湛謙,方桂珍,等.核桃楸總黃酮及胡桃醌含量測定[J].林產化學與工業,2006,26(2):93～95.

[7]王立娟.微波輔助提取山楂葉總黃酮的條件研究[J].林產化學與工業,2006,26(3):131～134.

[8]Graham H D. Stabilization of the Prussian blue color in the determination of polyphenols[J].J Agric Food Chem,1992,40:801～805.

[9]席先蓉,李壽星.蒲黃及不同炮制品中總黃酮和多糖含量分析[J].中國中藥雜志,2000,25(1):25～28.

[10]PRIYANKA K, MISHRA S B. Biochemical markers for cold tolerance in Boro rice[J].Indian J Genet,2001,61:23～26.