高血糖大鼠藍斑核神經原一氧化氮合酶的改變

孫永杰

高血糖大鼠藍斑核神經原一氧化氮合酶的改變

孫永杰

目的觀察高血糖大鼠藍斑核NOS陽性反應物的變化。方法用腹腔注射四氧嘧啶法建立高血糖大鼠動物模型。用酶組織化學和圖像分析方法觀察大鼠藍斑核NOS細胞的變化。結果高血糖大鼠藍斑核NOS細胞陽性反應物減弱(P＜0.01)。結論NOS陽性反應物減少與高血糖的發生、發展有關。

高血糖;藍斑核;一氧化氮合酶;大鼠

一氧化氮是一種神經遞質，也是一種重要生理功能的信使分子，既溶于水又溶于脂，是非?；钴S的化學物質，參與多種生理過程。一氧化氮系在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化下由L-精氨酸氧化產生，一氧化氮合酶是一氧化氮合成的關鍵因素［1］，廣泛存在于中樞神經系統。目前，已有許多研究表明，藍斑核所含去甲腎上腺素能神經元群，通過上、下行投射，幾乎終止于全腦和脊髓灰質各部，從而影響腦的整體活動，如:控制注意力水平;調節覺醒-睡眠周期;參與胃腸道和呼吸道反射;參與介導所在網狀結構的心血管、血壓和化學感受器反射，并對痛覺傳遞進行調制等［2］。但關于高血糖時藍斑核內NOS的含量是否發生改變尚未見報道。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 雄性Wistar大鼠(中國醫科大學動物室提供)，NADPH-d、四硝基唑藍(NBT)、TritonX-100(購于 Sigma

公司);四氧嘧啶(購于Sigma公司);LUZEX-F顯微圖像分析儀(日本，松下公司);日立H-600透射電鏡。

1.2 實驗動物分組 本實驗選用雄性Wistar大鼠40只，體質量260～300 g，隨機分成2組。正常對照組:20只。實驗組:20只。

1.3 實驗方法

1.3.1 高血糖大鼠模型制備 實驗動物禁食12 h。實驗組腹腔一次注射200 mg/kg四氧嘧啶，正常對照組注射等體積的0.9%氯化鈉注射液。6周后取材。

1.3.2 組化標本制備 對實驗動物用1%戊巴比妥鈉(40 ml/kg)腹腔麻醉后開胸，經左心室70滴/min滴入1%肝素鈉的0.9%氯化鈉注射液500ml，同時剪開右心耳。繼用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)配制的固定液(含4%多聚甲醛)灌流固定。取出實驗動物的大腦組織，放入含4%多聚甲醛PBS的固定液中進行后固定大約2 h，之后將實驗動物的大腦組織切成薄片移入含20%蔗糖的PBS中。在4℃冰箱中存放，至組織薄片沉底，經水包埋，恒冷箱連續橫切片，片厚20 μm。經OCT包埋，恒冷箱連續切片，片厚16 mm，-70℃保存備用。

1.3.3 尼氏染色 冰凍切片吹干，經PBS漂洗5min×3次，將切片置入1%甲苯胺藍溶液中37℃孵育90min，取出后用蒸餾水沖洗，PBS漂洗5min×3次，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.3.4 一氧化氮合酶組織化學方法 染色方法:NOS酶組織化學染色:在2 g/LTritonX-100磷酸緩沖液中預孵育5～10 min(室溫);在下列孵育液中反應2 h(37℃):NADPH-d 10 mg，四硝基唑藍(NBT)5 mg ，TritonX-100 0.03 ml，用0.1 mol/L PBS新鮮配制成100 ml;用PBS終止反應、漂洗;梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.4 統計學方法 采用SPSS11.5軟件包進行統計分析，計量資料采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 尼氏染色結果 正常對照組大鼠藍斑核區的尼氏染色切片上，神經元數量較多，排列緊密，形態完整，泡漿內尼氏體豐富。實驗組，正常神經元數量減少，細胞皺縮，有的溶解成碎片。

2.2 NOS酶組化結果 正常對照組和實驗照組NOS陽性反應物分布于藍斑核，多為錐體細胞，陽性反映物呈深蘭色，分布在細胞質及突起，胞核不著色。實驗組，NOS陽性細胞數量減少，其形態不同于正常NOS陽性細胞，細胞小，突起少，著色淺且大部分局限于細胞膜。見圖1。

圖1 高血糖大鼠藍斑核區單位面積NOS陽性物平均灰度值

3 討論

目前已知NOS有二類:原生型NOS(cNOS)和誘導型(iN-OS)［3］。在生理狀態下cNOS參與各種活動的調節，其作用時間短，生成的一氧化氮少。iNOS在正常生理狀態下表達較少，但在病理狀態下，經某些細胞因子和內毒素等的誘導，表達增多，iNOS的作用時間長，可催化產生大量的一氧化氮。在實驗中，我們觀察到，大鼠藍斑核NOS酶反應陽性細胞及纖維數量顯著減少，結果提示NOS可能參與高血糖的病理生理過程，可作為神經元受損的標示物。

［1］ Bolanos JP，Almeida A.Roles of nitric oxide in brain hypoxiaischemia.Biophys Acta，1999，1411:415-436.

［2］ 柏數令.系統解剖學.人民衛生出版社，2008:345.

［3］ Carthwoite J.Clutamate，nitric oxide and cell-cell signalling in the nervous system.Trends Neurosci，1991，14:60-67.

Investigation on the change of nitric oxide synthetase positive neurons in locus ceruleus of rats with hy-perglycemia

SUN Yong-jie.
Liaoning Health College of Vocational Technology Shen Yang 110101，China

ObjectiveTo observe the expression of nitric oxide synthetase(NOS)in Locus Ceruleusneurons with hyperglycemia.MethodsNADPH-d histochemical method was used.ResultsNOS positive neurons expressed in Locus Ceruleus and nomal neurons of 6 weeks old rats with hyperglycemia(DM)and normal rats(NC).There was significant difference in neurons between DM group and control group.ConclusionThere is a relationNOS positive neurons decrease in Locus Ceruleus of rats with hyperglycemia.

Hyperglycemia;Locus ceruleus;NOS;Rat

110101遼寧衛生職業技術學院

·臨床醫學·