甘松揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合工藝研究

王靜，邢煜軍，張保國，李欽*

(1.河南大學中藥研究所，河南開封475004;2.河南大學藥學院，河南開封475004)

甘松為敗醬科植物甘松Nardostachys chinensisBatla.或匙葉甘松Nardostachys jatamansiDC.的干燥根及根莖，其味辛、甘，性溫，具有理氣止痛，開郁醒脾之功效［1］。是目前敗醬科中唯一被《中國藥典》2010年版收載的藥用植物，甘松的主要成分為揮發(fā)油［2］。

現(xiàn)代藥理研究表明，甘松揮發(fā)油有鎮(zhèn)靜、解痙、降壓、抗心律失常、抑菌等作用，但有刺激性氣味，而β-環(huán)糊精包合物有增加藥物溶解度、液體藥物粉末化以及防止揮發(fā)油揮發(fā)的作用［3］，本實驗利用β-環(huán)糊精對甘松揮發(fā)油進行包合，比較3種包合物制備方法，并通過正交實驗優(yōu)選出最佳包合工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器TB-Ⅲ型恒溫磁力攪拌器(金壇市杰瑞爾電器有限公司)，KQ5200DA型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，F(xiàn)A1004電子天平(十萬分之一，上海楚定分析儀器有限公司)，SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 試藥甘松(購自開封市天濟大藥房，經(jīng)河南大學中藥研究所李欽教授鑒定為甘松Nardostachy chinensisBatla.的干燥根及根莖)，β-環(huán)糊精(孟州市華興生物化工有限責任公司)，其余試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的提取取甘松藥材(過20目篩)適量，加10倍量水，浸泡3 h，按水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油6 h，用無水硫酸鈉脫水后即得，揮發(fā)油提取率約為2.5%，相對密度為0.967 g/mL。

2.2 包合方法的篩選β-環(huán)糊精包合物常用的制備方法有飽和水溶液法、研磨法和超聲法［4］，參考相關(guān)文獻［5］，本實驗分別采用3種方法對甘松揮發(fā)油進行包合。

2.2.1 包合物的制備

2.2.1.1 飽和溶液法精密稱取β-環(huán)糊精6 g，加蒸餾水75 mL置恒溫磁力攪拌器上，60℃攪拌溶解，使成飽和溶液，緩緩滴加揮發(fā)油1 mL(事先用無水乙醇4 mL稀釋)，恒溫攪拌0.5 h，冷卻至室溫，放入冰箱冷藏24 h，抽濾，包合物用石油醚沖洗3次(10 mL/次)，室溫放置過夜，自然揮干，即得β-環(huán)糊精包合物。

2.2.1.2 研磨法精密稱取β-環(huán)糊精6 g，加4倍量蒸餾水研磨3 min后，用滴管緩緩加入1 mL揮發(fā)油(事先用4 mL無水乙醇稀釋)，研磨0.5 h，放入冰箱中冷藏24 h，抽濾，以下操作同飽和水溶液法。

2.2.1.3 超聲法精密稱取β-環(huán)糊精6 g于具塞三角瓶中，加入蒸餾水75 mL，超聲使混和均勻，取1 mL揮發(fā)油(事先用無水乙醇4 mL稀釋)，在超聲過程中逐滴加入，溫度控制在60℃，超聲0.5 h，取出，冷卻至室溫，放入冰箱冷藏24 h，抽濾，以下操作同飽和溶液法。

2.2.2 揮發(fā)油空白回收率測定方法精密量取揮發(fā)油1 mL置500 mL圓底燒瓶中，加蒸餾水200 mL，按《中國藥典》2010年版一部附錄X D揮發(fā)油測定法甲法測定，收集揮發(fā)油至油不再增加為止，計算揮發(fā)油的空白回收率為88%，空白回收率=［收集揮發(fā)油量(mL)/加入揮發(fā)油量(mL)］×100%，結(jié)果見表1。

表1 空白回收率實驗(n=3)

2.2.3 包合物中揮發(fā)油的測定分別取以上3種制備方法制得的β-環(huán)糊精包合物6 g于500 mL圓底燒瓶內(nèi)，加蒸餾水200 mL，按《中國藥典》2010年版一部附錄X D揮發(fā)油測定法甲法提取揮發(fā)油，對油利用率、包合物收率及含油率3個指標進行考察時，根據(jù)實際生產(chǎn)情況，揮發(fā)油利用率權(quán)重系數(shù)為0.6，包合物收率為0.3，含油率為0.1，進行綜合評價，結(jié)果見表2。研磨法優(yōu)于另兩種方法。

表2 3種包合方法的比較(±s，n=3)

表2 3種包合方法的比較(±s，n=3)

研磨法72.92±0.78飽和水溶液法57.86±0.76超聲法40.53±0.55

2.2.4 考察指標

①包合率(%)=［包合物含油量(mL)/(揮發(fā)油投入量(mL)×空白回收率］×100%。

②包合物收率(%)=［包合物質(zhì)量(g)/β-環(huán)糊精質(zhì)量(g)+揮發(fā)油質(zhì)量(g)］×100%。

③包合物含油率(%)=［包合物提取的揮發(fā)油質(zhì)量(g)/包合物質(zhì)量(g)］×100%。

④綜合評分=包合率×0.6+包合物收率×0.3+含油率×0.1。

2.3 包合工藝條件的考察

2.3.1 無水乙醇與95%乙醇稀釋揮發(fā)油包合效果的考察

精密稱取β-環(huán)糊精6 g，2份，分別于研缽中，加4倍量蒸餾水，研磨3 min，緩慢加入1 mL揮發(fā)油(分別用無水乙醇和95%乙醇4 mL稀釋)，再研磨30 min，抽濾，包合物用少量水洗后再用石油醚沖洗3次(10 mL/次)，室溫放置過夜，自然揮干，即得β-環(huán)糊精包合物，按2.2.3項及2.2.4項的方法，測定包合物中揮發(fā)油的量，結(jié)果表明，用無水乙醇稀釋揮發(fā)油包合效果優(yōu)于95%乙醇(見表3)。

2.3.2 無水乙醇用量包合揮發(fā)油效果的考察精密稱取β-環(huán)糊精6 g，3份，分別于研缽中，加入4倍量蒸餾水，研磨3 min，緩慢加入1 m L揮發(fā)油(事先分別用2 mL，4 mL，6 mL無水乙醇稀釋)，再研磨0.5 h，抽濾，包合物用少量水洗后再用石油醚沖洗3次(10 mL/次)，室溫放置過夜，自然揮干，即得β-環(huán)糊精包合物按2.2.3項及2.2.4項的方法，測定包合物中揮發(fā)油的含量，結(jié)果表明，4 mL無水乙醇稀釋揮發(fā)油包合效果最好(見表4)。

表3 無水乙醇與95%乙醇稀釋甘松揮發(fā)油包合結(jié)果(±s，n=3)

表3 無水乙醇與95%乙醇稀釋甘松揮發(fā)油包合結(jié)果(±s，n=3)

包合物收率/%溶媒包合率/%包合物含油率/%綜合評分無水乙醇77.27±1.97 84.79±2.31 11.14±0.78 72.92±0.78 95%乙醇58.35±1.29 83.13±1.66 8.15±1.15 60.75±0.70

表4 不同無水乙醇用量溶解甘松揮發(fā)油包合結(jié)果(±s，n=3)

表4 不同無水乙醇用量溶解甘松揮發(fā)油包合結(jié)果(±s，n=3)

2 62.40±0.77 4 72.92±0.78 71.28±1.14 6

2.4 正交試驗優(yōu)選包合工藝條件

2.4.1 正交試驗選擇β-環(huán)糊精與揮發(fā)油投料配比、β-環(huán)糊精與水配比、研磨時間3個因素，每個因素選取3個水平，以2.2.4項考察指標的綜合評分為指標，采用L9(34)正交表安排試驗，對研磨法進行考察，設(shè)計方案見表5，試驗結(jié)果見表6，方差分析見表7。

表5 因素水平表

表6 甘松揮發(fā)油包合正交試驗結(jié)果

2.4.2 結(jié)果分析從表6直觀分析可以看出，影響包合效果的因素的順序為A＞B＞C，從表7的方差分析可以看出，因素A、因素B對包合效果具有顯著性影響，最終確定最佳包合工藝為:A2B1C2，即取β-環(huán)糊精6 g，蒸餾水12 mL，加揮發(fā)油1 mL，研磨30 min。

表7 方差分析結(jié)果

2.4.3 工藝試驗按上述最佳包合條件，重復試驗3次，結(jié)果平均包合物收率90.42%，平均包合率為96.97%，平均含油率為13.41%，因此確定該工藝為最佳包合條件。結(jié)果見表8。

表8 工藝試驗結(jié)果(n=3)

2.4.4 包合物TLC驗證取甘松揮發(fā)油5滴，加入石油醚5 m L，搖勻，制成供試品溶液1;取從包合物中提取的揮發(fā)油5滴，加入石油醚5 mL搖勻，制成供試品溶液2;取β-環(huán)糊精包合物0.1 g，加石油醚5 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液為供試品溶液3;取β-環(huán)糊精0.1 g，加石油醚5 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液為供試品溶液4;取β-環(huán)糊精0.1 g，加甘松揮發(fā)油5滴，再加石油醚5 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液為供試品溶液5。照《中國藥典》2010年版一部薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗，吸取上述5種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯(9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，供試品2與供試品5色譜中，在與供試品溶液1色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，說明包合前后揮發(fā)油主要成分無差異。在供試品溶液1斑點對應處，β-環(huán)糊精及β-環(huán)糊精包合物未見斑點，說明揮發(fā)油已形成包合物而非混和物(見圖1)。

圖1 包合物中揮發(fā)油TLC圖

3 討論

3.1 在制備過程中，包合物溶液冷藏1 d后，抽濾，需用石油醚洗去殘留在包合物外面的揮發(fā)油，以免影響揮發(fā)油利用率。

3.2 進行空白回收率測定，是因為盡管提取至揮發(fā)油量不再增加，但熱水中仍留少量的揮發(fā)油，為減小誤差，需對結(jié)果進行校正。

3.3 β-環(huán)糊精包合物驗證方法有X射線衍射法、紫外光譜法、紅外光譜法、薄層色譜法、顯微觀察法、熱分析法等［6-8］，本試驗選用薄層色譜法，操作簡便，準確度較高。包合前后揮發(fā)油中主要成分沒有明顯改變，可能是由于β-環(huán)糊精分子與甘松揮發(fā)油的包合主要是由于分子間吸引力的作用。

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