不同方法提取海螵蛸多糖及結構表征

唐麗娟， 劉瑋煒， 王 麗， 陳潔林

(淮海工學院化學工程學院，江蘇連云港222005)

海螵蛸是一味傳統海洋中藥，為烏賊科Sepiidae海洋動物無針烏賊Sepiella maindionide Rochebrune或金烏賊Sepia esculenta Hoyle的干燥內殼。海螵蛸的藥用價值早見于《本經》、《本草綱目》等古代藥學巨著，記載海螵蛸具收斂、止酸、止血、澀精止帶、斂瘡等功效［1］。近年來，許多中外學者運用現代方法對海螵蛸的藥理作用和臨床應用進行了研究。證實海螵蛸具有抗胃潰瘍［1-2］、成骨［3-4］、凝血［5］等作用。然而其作用機理尚不十分明確，就海螵蛸粉治療胃潰瘍等消化性潰瘍疾病來說，目前臨床研究認為與海螵蛸中主要成分碳酸鈣［6］有關，能保護胃黏膜或抑制胃蛋白酶活性等［7-8］。然而海螵蛸中含有黏液、多糖及酶等物質［9］，魏江洲等［10］水提法獲得海螵蛸多糖并進行體內實驗，闡明了海螵蛸作為潰瘍用藥的藥物作用機制。在文獻基礎上，本實驗利用連云港產海螵蛸為研究材料分別采用水提法和堿提法提取多糖，并通過紅外譜圖對多糖結構進行了表征分析。此研究工作為海螵蛸資源的深入研究及中成藥開發提供了一定的理論基礎。

1 實驗部分

1.1 原料、試劑和儀器

1.1.1 原料 新鮮海螵蛸(江蘇連云港產，購于連云港新浦區蒼梧生活廣場)，經江蘇省海洋生物技術重點實驗室閻斌倫主任鑒定為金烏賊(Sepia esculenta Hoyle)內殼。

1.1.2 試劑和儀器 乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、苯酚等均為國產分析純。旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，722S可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)，WGH-30/6型雙光束紅外分光光度計(天津市港東科技發展有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 水提法提取海螵蛸粗多糖 將新鮮海螵蛸洗凈晾干后研成粉末(過200目篩)，先用95%乙醇攪拌浸泡24 h，殘渣用1.5 mol/L的鹽酸常溫浸泡24 h(其間強力攪拌)，抽濾，熱水攪拌浸提濾渣，抽濾，殘渣重復提取兩次，合并3次水提液。濃縮水提液至原來體積的一半，6000 r/min離心10 min。上清液用sevage法(三氯甲烷-正丁醇=4∶1)反復除蛋白3次。濃縮上述提取液，加入2倍體積無水乙醇，攪拌均勻，室溫靜置過夜，次日，離心棄上清液，將沉淀復溶于蒸餾水，再離心，棄去不溶物，第2次醇沉，所得沉淀用蒸餾水溶解后透析48 h，透析液冷凍干燥，得海螵蛸多糖粗品，參照文獻［11］苯酚-硫酸法測多糖量。

1.2.2 堿提法提取海螵蛸粗多糖 將水提后的殘渣，以0.5%氫氧化鈉堿溶液80℃攪拌浸提4 h。將堿提多糖溶液，用2 mol/L的鹽酸溶液中和至pH=7.0，出現渾濁，進行旋轉蒸發，將濃縮液抽濾，分別收集沉淀與清液，沉淀即為堿提水不溶多糖，干燥后稱質量。然后將清液以流動水透析24 h，透析結束后向溶液中加入2～3倍無水乙醇，4℃下靜置過夜，離心收集沉淀，該沉淀即為堿提水溶多糖［12］，干燥后稱質量，計算兩種多糖總提取率［堿提多糖總提取率=(堿提水不溶多糖質量+堿提水溶多糖質量)/提取原料質量×100%］。

2 結果與討論

2.1 水提法提取海螵蛸多糖

2.1.1 液固比對海螵蛸水提多糖量的影響 分別準確稱取50 g海螵蛸粉末，脫鈣后殘渣按液固比為4∶1、6∶1、8∶1加入蒸餾水，于70℃提取6 h，測多糖量。結果見圖1。實驗結果表明隨著液固比的增加，多糖的提取率并沒有提高反而呈下降趨勢。在液固比為4∶1時，多糖提取率最大。而液固比為6∶1或8∶1時提取率較低，分析其原因可能是由于隨著傳質推動力的加大，隨多糖一起浸出的雜質也增多，但在醇沉時，這些雜質沒有隨多糖一塊沉淀，而且有可能夾雜一些多糖保留在醇溶液中［13］。

圖1 液固比對水提多糖量的影響

2.1.2 提取溫度對海螵蛸水提多糖量的影響 50 g海螵蛸粉末脫鈣后殘渣以液固比為4∶1，分別于70℃、80℃、90℃提取6 h，測多糖量，見圖2。從圖2看出，溫度對海螵蛸多糖提取率有顯著的影響。在70℃到80℃時，隨著溫度的升高，多糖提取率呈逐漸增大趨勢。之后，隨著溫度的升高，多糖量明顯下降，因此確定80℃時為較佳的提取溫度。

圖2 提取溫度對水提多糖量的影響

2.1.3 提取時間對海螵蛸水提多糖量的影響 液固比為4 ∶1，于80 ℃分別提取4 h、6 h、8 h，多糖量測定結果見圖3。隨著浸提時間的增加，多糖的得率并沒有增加趨勢，6 h多糖得率最高，時間延長，導致多糖在提取溫度下發生結構變化而使多糖有所損失。故提取時間選取6 h。

圖3 提取時間對水提多糖量的影響

2.1.4 水提法重復性實驗 取海螵蛸粉末3份各100 g，以上述獲得的水提較佳工藝條件即提取溫度80℃，液固比4∶1，提取時間6 h按1.2.2項進行3次平行提取實驗(n=3)，結果見表1，RSD為4.39%，表明該方法較可靠。

表1 水提多糖重復性實驗結果

2.2 堿提法提取海螵蛸多糖

2.2.1 提取時間對海螵蛸堿提多糖得率的影響 將水提后的殘渣晾干后稱等量的3份，以0.5%氫氧化鈉堿溶液80℃條件下浸提4 h、6h、8 h，測定不同提取時間對海螵蛸堿提多糖得率的影響。由圖4可知，提取時間對提取結果有一定的影響。提取時間短如4 h時，多糖提取率明顯減少。當提取時間達6 h時，多糖的提取率達到較高，繼續增加時間反而有所下降，故將多糖的最佳提取時間定為6 h。

圖4 浸提時間對堿提海螵蛸多糖得率的影響

2.2.2 氫氧化鈉溶液質量濃度對海螵蛸堿提多糖得率的影響 將水提后的等量殘渣，分別以0.5 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L不同質量濃度氫氧化鈉堿溶液80℃條件下浸提6 h，測定不同氫氧化鈉溶液質量濃度對海螵蛸堿提多糖提取率的影響，結果見圖5。隨著稀堿提取質量濃度的增加，多糖的提取率逐步增加，當堿提質量濃度大于1.0 mol/L時，增幅有減小的趨勢，當堿質量濃度大于1.5 mol/L時，提取率增加趨勢平緩，可能是因為堿溶液質量濃度過大而破壞多糖的結構，另外隨著濃度的提高，溶液的黏度不斷增大，給后續的過濾、離心等環節增加不少工藝上困難。因此綜合提取率及操作方便堿質量濃度選擇1.5 mol/L。

圖5 堿溶液質量濃度對多糖提取率的影響

2.2.3 提取溫度對海螵蛸堿提多糖提取率的影響 將水提后的等量殘渣，以1.5 mol/L氫氧化鈉堿溶液于60℃、80℃、90℃、100℃條件下浸提6 h，測定不同提取溫度對海螵蛸堿提多糖提取率的影響，結果見圖6。由圖6可以看出，在80℃時多糖的提取率最高，這可能因為低溫時溶液中多糖不能得到充分提取;溫度過高時，多糖有少量降解為可溶性單糖或低聚糖，而使提取率有所下降。因此選80℃為較佳提取溫度。

圖6 浸提溫度對海螵蛸多糖的影響

2.2.4 堿提法重復性實驗 取3份水提后殘渣各100 g，以上述獲得的堿提較佳工藝條件即提取溫度80℃，氫氧化鈉溶液質量濃度1.5 mol/L，提取時間6 h進行3次平行提取實驗(n=3)，結果見表2，RSD為3.87%，表明該方法重復性較好。

表2 重復性實驗結果

2.3 海螵蛸粗多糖結構表征

水提海螵蛸粗多糖:3492.0 cm－1強而寬吸收峰為多糖O-H 的伸縮振動，形成分子內氫鍵［14］，2800.0 cm－1小肩峰為C-H的伸縮振動，1630.0 cm－1中強吸收峰為C=O伸縮振動，1378.0 cm－1為 C-H 的彎曲振動，1100.0 cm－1的峰即C-O伸縮振動，562.0 cm－1為O-H面外彎曲振動。

堿提水溶性多糖:3408.0 cm－1為多糖O-H的伸縮振動;1582.0 cm－1為 C=O 伸縮振動;1350.0 cm－1為 C-H 彎曲振動，1254，1106.0 cm－1是 C-O 伸縮振動。

堿提水不溶多糖:3292.0 cm－1為O-H伸縮振動，形成分子間氫鍵;2928.0 cm－1是 C-H 伸縮振動;1582.0 cm－1C=O伸縮振動;1358.0糖環亞甲基C-H彎曲振動;1070.0 cm－1是C-O伸縮振動，在772.0 cm－1處的吸收則為吡喃對稱環的伸縮振動。

從以上各種多糖的紅外譜圖分析可以看出，經水提和堿提獲得的3種提取物均有多糖特征，如均在3600～3200 cm－1區域形成寬而強的峰，歸屬為糖分子中羥基的伸縮振動;分別在 1630.0，1582.0，1582 cm－1表現出酰胺Ⅰ帶和Ⅱ帶的吸收峰，表明多糖提取物中均可能存在酰胺基;在1200，1100 cm－1附近的吸收峰為C-O伸縮振動的吸收峰，是糖環的醚鍵(C-O-C)和羥基的吸收峰，表明粗多糖均可能存在糖環內醚結構。

但各多糖結構不完全相同，首先氫鍵類型不同:水提多糖和堿提多糖是分子內氫鍵，而堿提水不溶性多糖是分子間氫鍵。另外糖環類型可能不同。在IR譜圖 中只有堿提水不溶性多糖在772.0 cm－1出現了吸收峰，表明其糖環可能是吡喃環構型。因此從紅外光譜數據可以初步判斷海螵蛸水提多糖和堿提多糖均具有多糖特征，但各多糖結構間存在著一定的差異。

3 結論

在水提法基礎上，以堿提法提取江蘇連云港產金烏賊海螵蛸中多糖。確定了水提法提取海螵蛸多糖的較佳工藝條件為提取溫度80℃，液固比4∶1，提取時間6 h得到多糖量約為1‰。海螵蛸堿提多糖的最佳工藝條件為:提取溫度80℃，氫氧化鈉溶液質量濃度1.5 mol/L，提取時間6 h，多糖提取率約為7.008‰。海螵蛸水提粗多糖和堿提粗多糖均具有多糖紅外光譜特征峰，水溶性多糖和堿提水溶性多糖紅外譜圖數據相似，堿提水不溶性多糖與前二者有一定差異。海螵蛸是傳統海洋中草藥，目前限于海螵蛸粉末的制劑配方，成分療效不明確。因此本實驗采用不同的提取方法獲得水提多糖和堿提多糖，為海螵蛸資源的深入研究及中成藥的開發提供一定的理論基礎。

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