萊菔子飲片中蘿卜苷測定方法的研究

呂文海， 任 濤， 孟祥紅， 蘇永汶

萊菔子是具“生熟異治”、“生升熟降”藥性特點的常用中藥，炒后長于消食除脹、降氣化痰［1］。經系統分析，發現萊菔子生、炒品中氣味和揮發性部位存有明顯的質變與量變成分，但兩者含量很微［2］。在水溶性部位中發現并分離鑒定了兩個含硫新化合物A209與B221，HPLC含測證明，二者主要存在于生萊菔子中，炒制后A209量顯著降低，B221未檢測到。A209 系 S-6-甲亞砜基甲基-1，3-噻嗪烷-2-硫酮，S-6-(methylsulfinyl)methyl-1，3-thiazinane-2-thione，CCDC號:742902;B221為 N-(E)-(4-甲亞砜基-3-丁烯基)胺基硫代甲酸乙酯，O-ethyl N-(E)-4(methylsulfinyl)but-3-enylcarba mothioate，CCDC 號:742907［3］。萊菔子生、炒品成分群 HPLC圖譜分析表明A209與B221是化合物C3在不同條件下的轉化產物，進一步證明C3為萊菔子素，萊菔子素是硫代葡萄糖苷類成分蘿卜苷的酶解產物［4-5］。在尚未分離到蘿卜苷對照品的情況下，以烯丙基硫苷為內標物，以HPLC圖譜中萊菔子硫苷與內標物峰面積之比為指標，比較不同炮制品中的硫苷相對質量分數并用均勻設計優選炮制工藝，證明炒萊菔子有利于硫苷類成分的保存［6］。

基于上述工作，本實驗建立了萊菔子水煎劑中蘿卜苷的HPLC測定方法，并證明了該方法在反映萊菔子生、制品特征方面的專屬性。

1 實驗材料

1．1 供試飲片

萊菔子購于鄄城良海中藥飲片有限公司，經山東中醫藥大學藥學院生藥系周鳳琴教授鑒定為十字花科植物蘿卜Raphanus sativus L．的干燥成熟種子，符合《中國藥典》(2010年版)藥用規定。按確定的凈制工藝凈選后作生萊菔子樣品。

炒萊菔子 按參考文獻［6］確定的工藝參數炒至質地鼓起，易脫皮，富油性并有爆裂聲和特有香氣溢出時，取出，晾涼。

萊菔子炒過品 在炒品的基礎之上繼續炒制，炒至顏色加深、表面焦糊時，取出，晾涼備用。

上述供試飲片，粉碎成粗粉，置干燥器內平衡水分后備用。

1．2 儀器與試劑 Agilent 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司);SB2200超聲波清洗機(上海必能信超聲有限公司)。

乙腈為色譜純(山東禹王實業有限公司)，其他試劑為分析純。

1．3 蘿卜苷對照品 自制。為淡黃色半固體油狀物，易溶于水，微溶于甲醇等極性較大的有機試劑。經MS、1H-NMR、13C-NMR 檢測，相關數據與文獻［7］對照，確定為蘿卜苷。HPLC面積歸一化法測定其純度大于92%。

2 實驗方法與結果

2．1 色譜條件 色譜柱為Phenomenex-C18(4．6mm×250 mm，5μm);以乙腈-0．1%的磷酸水溶液(5∶95)為流動相;設定體積流量1．0 mL/min，柱溫30℃，進樣量20μL;經蘿卜苷全波長掃描(見圖1)，以225 nm為檢測波長，360 nm為參比波長。

圖1 蘿卜苷紫外吸收光譜圖Fig．1 UV spectra of glucoraphenin

2．2 供試品溶液的制備 根據蘿卜苷的溶解性，按照中醫主用湯劑入藥的實際，采用水回流提取制備萊菔子供試樣品:取供試品粉末0．1 g，精密稱定。置50 mL燒瓶中，精密加水25 mL，浸泡30 min，稱定質量。回流提取1．0 h，補足損失質量，抽濾，濾液經0．45μm微孔濾膜過濾后備用。

2．3 對照品溶液的制備 精密稱取蘿卜苷對照品0．007 55 g，純凈水溶解，定容至10 mL。依次稀釋配制成質量濃度為 0．755、0．604、0．453、0．302、0．151、0．075 5、0．037 8 mg/mL 的對照品溶液。

2．4 蘿卜苷HPLC檢測方法學考察

2．4．1 線性關系考察 用2．3項中的對照品溶液，按2．1項下色譜條件測定，以峰面積(Y)對蘿卜苷質量濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程為Y=12 428X+38．398(r=0．999 8)。實驗表明蘿卜苷質量濃度在0．755～0．037 8 mg/mL范圍內，峰面積與質量濃度呈良好的線性關系。

2．4．2 精密度實驗 取2．3項下質量濃度為0．302 mg/mL的蘿卜苷對照品溶液，按2．1項下色譜條件連續進樣5次，測定蘿卜苷的峰面積為:3 729．8、3 746．8、3 760．4、3 772．3、3 789．8，平均值為3 758．8，RSD 為0．61%，表明儀器精密度良好。

2．4．3 穩定性實驗 按2．2項下方法制備炒萊菔子供試品溶液，分別于 0、0．5、1、2、4、6、8 h 時按 2．1項下色譜條件進樣，根據蘿卜苷的峰面積計算其質量分數(%)，分別為:8．13%、8．08%、8．11%、8．13%、8．12%、8．20%、8．13%，平均值為 8．13%，RSD為0．44%，表明供試品溶液在制備后8 h內穩定性良好。

2．4．4 重現性實驗 按2．2項下方法平行制備炒萊菔子供試品溶液5份，按2．1項下色譜條件進樣，根據蘿卜苷的峰面積計算其質量分數，分別為:8．08%、7．78%、8．02%、8．21%、8．05%，平均質量分數為8．03%，RSD=1．96%，表明方法的重現性良好。

2．4．5 加樣回收率實驗 精密稱取5份已知量的炒萊菔子樣品各0．1 g，用減重法加入與待測樣品蘿卜苷量近似的蘿卜苷對照品，按樣品測定方法處理，測定，計算加樣回收率。結果見表1，實驗表明本方法回收率符合測定要求。

表1 炒萊菔子供試品加樣回收率實驗結果Tab．1 Results of plus samp le Recovery in Raphani Semen

2．5 萊菔子不同炮制品中蘿卜苷的測定 分別取萊菔子生、炒、炒過品各0．1 g，精密稱定。按2．2項下要求制備供試品溶液，并按2．1項下色譜條件進樣，進行測定。結果見表2，實驗表明，萊菔子炒品中蘿卜苷是生品的8．55倍，如炒過則蘿卜苷損失殆盡。實驗證明蘿卜苷量可以客觀反映萊菔子的炮制程度，具有質量控制上的專屬性。HPLC圖見圖2。

表2 萊菔子不同炮制品中蘿卜苷測定結果(n=3)Tab．2 Determ ination of glucoraphenin in different processed Raphani Semen(n=3)

圖2 萊菔子不同炒制品圖譜Fig．2 Spectra of different roasted Raphani Semen

3 小結與討論

建立能反映中藥炮制過程中相關成分變化，控制飲片炮制程度的專屬性質控方法，是中藥炮制機理研究的重要內容，是使飲片炮制規范化的關鍵技術。本實驗首次從炒萊菔子中分離純化了其所含硫苷類化合物的主成分蘿卜苷，并建立了萊菔子水提液中蘿卜苷的HPLC測定方法。

實驗結果表明，在萊菔子炒制達到優選工藝中形、色、氣、味、質要求的前提下，其水煎劑中蘿卜苷量是生萊菔子的8．55倍，如炒過，蘿卜苷則無法檢出。結合炮制品性狀要求，蘿卜苷定量測定可作為有效反映萊菔子炮制程度的專屬性質量控制方法。

實驗中發現，萊菔子如僅微炒，在達不到傳統要求的形體鼓起，種皮易捻脫，富含油性，具濃郁特殊香氣等性狀要求時，蘿卜苷的量要高于優選工藝炮制品。但中藥飲片是為中醫臨床服務的，炮制中特有的“火候”要求，是在長期臨床驗證中形成的，在飲片入藥的形式下，飲片的特有性狀要求必須得到充分的繼承。否則，僅以蘿卜苷量為標準，獲得的將是臨床不認可的炒萊菔子，性狀與蘿卜苷定量測定相結合的方法，可以更客觀有效地保證萊菔子的炮制質量。這在中藥炮制機理和質量控制方法研究中必須引起足夠的重視。

［1］龔千鋒．中藥炮制學［M］．北京:中國中醫藥出版社，2005:109．

［2］張 欣，王愛武，宿廷敏，等．萊菔子生制品揮發性成分GC-MS分析［J］．中成藥，2008，30(1):96-98．

［3］Zhang Xin，Liu Hongbing，Jia Jingjing，et al．Two novel sulfur compounds from the seeds of Raphanus sativus L．［J］．J Asian Nat Prod Res，2010，12(2):113-118．

［4］任 濤，呂文海，張 欣，等．萊菔子炮制前后成分群變化的初步研究［J］．中成藥，2009，31(11):1715-1718．

［5］呂文海，任 濤，蘇永汶，等．炮制抑制萊菔子中蘿卜苷酶解轉化的初步研究［J］．中國中藥雜志，2011，36(8):980-983．

［6］任 濤，呂文海．以硫代葡萄糖苷相對含量優選萊菔子炮制工藝研究［J］．中成藥，2010，32(7):1159-1162．

［7］Iori R，Barillari J，Gallienne E，et al．Thio-functionalised glucosinolates:unexpected transformation of desulfoglucoraphenin［J］．Tetrahedron Lett，2008，49:292-295．