天山雪蓮凝膠劑質量標準研究

黃賢慧， 邢建國， 王新春，， 袁 勇， 陳衛軍

(1.石河子大學藥學院，新疆石河子832002;2.新疆維吾爾自治區藥物研究所，新疆烏魯木齊830004;3.石河子大學醫學院第一附屬醫院，新疆石河子832008)

天山雪蓮凝膠劑由天山雪蓮單味藥材制成的維藥新制劑，具有補腎活血，強筋骨，營養神經，調節異常體液等功效［1］，是治療風濕性關節炎，關節疼痛的有效藥物［2-3］。綠原酸和蘆丁是天山雪蓮中主要藥效成分［4-5］。為有效控制制劑質量，本試驗建立了同時測定天山雪蓮凝膠劑中綠原酸和蘆丁的高效液相色譜法和鑒別天山雪蓮凝膠劑中綠原酸和蘆丁的薄層色譜法，結果所建立的方法準確、可靠、專屬性強，能有效控制天山雪蓮凝膠劑的質量，為天山雪蓮凝膠劑質量標準的研究提供了實驗依據。

1 儀器與試藥

日本島津LC-20AT高效液相色譜儀(LC-20AT二元高壓泵，SPD-M20A二極管陣列檢測器，SIL-20A自動進樣器);pH酸度計(上海雷磁儀器廠);NDJ-1旋轉黏度計(上海精密科學儀器有限公司);AE-200電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);Millipore simplicity-185超純水器(美國密理博公司)。綠原酸對照品(批號:110753-200413)，蘆丁對照品(批號:100080-200707)均由中國藥品生物制品檢定所提供。甲醇、乙腈為色譜純(SK Chemicals公司)，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。天山雪蓮凝膠劑由石河子大學藥學院制備。

2 方法與結果

2.1 性狀 本品為棕黃色半固體，均勻且細膩，稠度適宜，涂展性好。

2.2 檢查

2.2.1 pH值 稱取凝膠劑約1.0 g，用10 g蒸餾水稀釋，在室溫下測定 pH，范圍為5.5 ～6.5。

2.2.2 黏度 采用NDJ-1旋轉黏度計(1號轉子、12 r/min)室溫測定，結果為(183±6)MPa·s。

2.2.3 其他 應符合凝膠劑項下的有關各項規定(《中國藥典》2010版一部附錄IQ)。

2.3 定性鑒別［6］取本品約0.25 g，置10 mL量瓶中，加甲醇10 mL，超聲5 min，離心，取上清液作為供試品溶液。同法處理空白凝膠，作為陰性對照溶液。另取天山雪蓮藥材約1.0 g，加入70%乙醇50 mL，回流提取1 h，離心，取上清液作為對照藥材溶液。再分別取綠原酸、蘆丁對照品適量，加甲醇溶解制成每1 mL含0.5 mg綠原酸和0.5 mg蘆丁的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗［2］，分別吸取上述5種溶液各10 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶6∶1∶2)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.1%亞硝酸鈉的1%甲醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。結果，供試品色譜在與對照品溶液色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點，而陰性對照品溶液無此斑點，見圖1。

圖1 天山雪蓮TLC鑒別

2.4 定量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱:Waters ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈(A)-0.4% 磷酸(B)，0 ～ 13 min 12%(A)，13 ～16 min 12%(A)-15%(A)，16 ～40 min 15%(A);檢測波長:353 nm;體積流量:1 mL/min;柱溫:35℃;進樣量:10 μL。在此色譜條件下，供試品中綠原酸及蘆丁的保留時間為 8.2 min和 31.2 min，理論塔板數依次為 4000、9000。色譜峰達到完全分離，綠原酸及蘆丁與相鄰峰的分離度均大于2且峰形對稱，綠原酸及蘆丁的對稱因子分別為1.17 和 1.13。

2.4.2 標準曲線的制備 分別精密稱取綠原酸、蘆丁對照品適量，加甲醇溶解，定容，所得綠原酸、蘆丁的質量濃度分別是 0.48 mg/mL、0.65 mg/mL，作為對照品貯備液;再分別精密吸取綠原酸、蘆丁對照品貯備液各2.5 mL至25 mL棕色量瓶，甲醇定容，配成綠原酸、蘆丁的質量濃度分別為48.0 μg/mL、65.0 μg/mL混合對照品貯備液。精密吸取混合對照品貯備液 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10 mL 至 10 mL 棕色量瓶，甲醇定容，搖勻，制成系列質量濃度的混合對照品，以峰面積A為縱坐標，綠原酸、蘆丁質量濃度C(μg/mL)為橫坐標繪制標準曲線，并進行線性回歸。綠原酸回歸方程為:A=12010C，r=0.9998，其質量濃度在 2.4 ～48.0 μg/mL 范圍內與峰面積呈良好的線性關系;蘆丁回歸方程為:A=18256C，r=0.9997，其質量濃度在 3.25 ～ 65.0 μg/mL 范圍內與峰面積呈良好的線性關系，且標準曲線通過原點，因此可采用外標一點法進行定量測定。

2.4.3 供試品溶液的制備 取本品約0.05 g，精密稱定，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇約15 mL，超聲5 min，放置至室溫，定容，取1.0 mL提取液至5 mL棕色量瓶中，甲醇定容，搖勻，離心10 min，取其上清液過0.22 μm濾膜，取續濾液，作為供試品溶液。

2.4.4 空白干擾試驗 按處方中各成分比例，制備不含天山雪蓮的空白凝膠，按“供試品溶液制備”方法制備空白溶液，依法測定，結果無干擾。見圖2。

2.4.5 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，按上述色譜條件，重復進樣6次，分別測定供試品溶液中綠原酸及蘆丁峰面積值，結果供試品綠原酸峰面積值RSD為0.58%;蘆丁峰面積值RSD為0.40%。

圖2 天山雪蓮凝膠HPLC圖

2.4.6 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，按上述色譜條件，每隔2 h測定供試品溶液中綠原酸及蘆丁峰面積值，共測定6次，結果供試品綠原酸峰面積值RSD為1.24%;蘆丁峰面積值RSD為1.06%。

2.4.7 重復性試驗 稱取本品6份，各約0.05 g，精密稱定，照2.4.3項供試品溶液的制備項處理，按2.4.1項測定項色譜條件進行測定，結果綠原酸峰面積值RSD為1.75%;蘆丁峰面積值RSD為1.93%。

2.4.8 加樣回收率試驗 分別取供試品凝膠6份，每份約0.025 g(含綠原酸約 0.8355 mg，含蘆丁約 1.669 mg)，精密稱定，分別置50 mL量瓶中，各精密加入混合對照品溶液，按照2.4.3項供試品溶液的制備項處理，離心10 min，取其上清液，過0.22 μm后，按2.4.1項測定項色譜條件進行測定，記錄色譜圖，并計算綠原酸平均回收率為101.18%，RSD為0.57%(n=6);蘆丁平均回收率為 102.12%，RSD 為 1.41%(n=6)。結果見表1。

表1 綠原酸及蘆丁回收率測定(n=6)

2.4.9 樣品測定 分別按照2.4.3項供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按2.4.1項色譜條件分別測定3批樣品。結果見表2。

表2 3批樣品測定結果(n=3)

3 討論

3.1 在建立檢測天山雪蓮凝膠劑樣品中的綠原酸和蘆丁的HPLC色譜條件時，參考相關文獻［7-8］，采用雙波長檢測法進行考察，即在327 nm處檢測綠原酸，257 nm處檢測蘆丁。結果，通過提取色譜圖發現，雙波長檢測法所得綠原酸和蘆丁的峰形及分離度均不理想。另參考中國藥典2010年版和相關文獻［9-10］，檢測波長為340 nm。通過提取色譜圖發現，綠原酸的分離度達不到要求，且蘆丁的峰形對稱性不理想。因此，本實驗依據全波段掃描結果(綠原酸最大吸收波長為325 nm，蘆丁最大吸收波長分別為254 nm及353 nm)，在檢測波長為353 nm，所得綠原酸和蘆丁色譜圖的峰形與分離度均達到要求。

3.2 在建立高效液相色譜法同時測定天山雪蓮凝膠劑中綠原酸和蘆丁色譜條件時，流動相的選擇參考文獻［11-12］，采用了甲醇-磷酸、乙腈-磷酸系統進行考察，結果乙腈(A)-0.4%磷酸(B)，0～13 min 12%(A)，13～16 min 12%(A)～15%(A)，16～40 min 15%(A)時，綠原酸和蘆丁的峰形均對稱，分離完全，陰性樣品無干擾。方法準確、靈敏、快速、重現性好，可作為該制劑的含量控制方法。

3.3 經3批樣品中綠原酸和蘆丁測定，綠原酸質量濃度在16.60～16.81 mg/mL，蘆丁質量濃度在 33.03 ～33.73 mg/mL，因此考慮到實際生產中天山雪蓮藥材的來源，以及提取、純化過程、儲藏環境等因素對含量的影響，故暫定本品:每克含綠原酸不得少于13.37 mg;每克含蘆丁不得少于26.70 mg。

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