重度子癇前期患者血清對外周血NK細(xì)胞殺傷活性的影響

魏軍，楊志英，楊在霞，劉彩霞

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

重度子癇前期患者血清對外周血NK細(xì)胞殺傷活性的影響

魏軍，楊志英，楊在霞，劉彩霞

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

目的研究重度子癇前期患者血清對NK細(xì)胞殺傷活性影響。方法 重度子癇前期患者組（病例組）、正常妊娠婦女組（對照組）各15例，采用1∶1配比的病歷對照研究。采用Percoll不連續(xù)密度梯度方法分離健康非孕婦女NK細(xì)胞，用10%、20%、40%濃度重度子癇前期患者血清及20%正常妊娠婦女血清孵育NK細(xì)胞20h，。采用MTT法檢測不同血清對NK細(xì)胞殺傷活性影響。結(jié)果 在用20%重度子癇前期患者血清及正常妊娠血清孵育20h后，重度子癇前期組NK細(xì)胞殺傷活性為（48.68±8.47）%，正常妊娠組為（35.21±8.24）%。與正常妊娠組相比，重度子癇前期組NK細(xì)胞殺傷活性增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在重度子癇前期組，用10%濃度血清孵育20h后，NK細(xì)胞殺傷活性為（39.98±7.65）%，40%濃度血清組為（58.33±7.45）%，重度子癇前期組中10%、20%、40%濃度血清組間兩兩相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=24.326，P<0.01）。結(jié)論子癇前期患者血清中某些因子可使NK細(xì)胞殺傷活性增強。

子癇前期；NK細(xì)胞；殺傷活性

子癇前期是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡的重要原因之一，其病因及發(fā)病機(jī)制始終是產(chǎn)科研究熱點。目前研究認(rèn)為，子癇前期是由于胎盤淺著床，滋養(yǎng)細(xì)胞及蛻膜淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞毒性因子入血，直接或間接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而引起子癇前期發(fā)病［1］。

NK細(xì)胞是一種大顆粒淋巴細(xì)胞，占外周血淋巴細(xì)胞10%。近年研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞是調(diào)控胎盤生長分化，誘導(dǎo)母體對被視為“半同種異體移植物”的胎兒產(chǎn)生免疫耐受的關(guān)鍵調(diào)節(jié)細(xì)胞之一［2］。我們在既往研究中發(fā)現(xiàn)，在重度子癇前期血清作用下，NK細(xì)胞通過LFA-1/ICAM-1和VLA-4/VCAM-1黏附通路，與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附增強，提示子癇前期血清可活化NK細(xì)胞，進(jìn)而參與子癇前期發(fā)病［3］。為進(jìn)一步探討重度子癇前期患者血清對NK細(xì)胞其他功能影響，本研究采用MTT方法，檢測子癇前期重度患者血清對NK細(xì)胞殺傷活性影響。

1 材料與方法

1．1 研究對象

選擇2006年1月至2008年1月中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京院產(chǎn)科門診及住院患者。采用1∶1配比的病歷對照研究。病例組：重度子癇前期患者15例，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第七版《婦產(chǎn)科學(xué)》［4］。年齡（30.67±3.83）歲，孕周（33.67±2.31）。對照組：與病例組年齡、孕周完全匹配的正常妊娠婦女15例，年齡（30.60±3.04）歲，孕周（32.87±2.42）。入選病歷無糖尿病、風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病等合并癥。

1．2 試劑和儀器

MTT購自Biomol公司，二甲基亞砜購自Amresco公司，Percoll分離液購自天津TBD生物技術(shù)有限公司。酶標(biāo)儀（MK3型）為Labsystem Dragon公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集：空腹抽取重度子癇前期患者及正常孕婦肘正中靜脈血4ml，室溫靜置20min，3500r/min離心3min，血清分裝于無菌管中，-70℃冰箱保存。

1.3.2 外周血NK細(xì)胞分離：（1）外周血單個核細(xì)胞分離：采健康非孕婦女肘正中靜脈血50ml，注入肝素抗凝無菌管中。加入等量PBS稀釋、吹打、混勻。離心管加淋巴細(xì)胞分層液，將稀釋血緩慢注入淋巴細(xì)胞分離液層面上。注意勿使血液混入分層液內(nèi)。在（18～20）℃下，以2500r/min離心30min。收取單個核細(xì)胞層，PBS洗滌3次。將獲得的單個核細(xì)胞懸浮于PBS中；（2）Percoll不連續(xù)密度梯度分離NK細(xì)胞：計數(shù)外周血單個核細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度。用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞配成107/ml濃度，傾倒于玻璃平皿，在37℃，5%CO2條件下孵育60min，每15～20min振搖1次，吸出的未黏附細(xì)胞為純化淋巴細(xì)胞懸液。用PBS按2.5%濃度遞減，從50%開始將percoll稀釋成6個濃度，每個濃度1ml，逐層疊入10ml離心管。將純化淋巴細(xì)胞懸液小心加入percoll分離液上層，2500r/min水平離心20min。收集42.5%和45.0%2層Percoll液，再次離心，PBS洗3次以去除Percoll介質(zhì)，細(xì)胞重懸于完全培養(yǎng)基。CD56單抗間接免疫熒光發(fā)鑒定純度，臺盼藍(lán)拒染法測存活率。NK細(xì)胞純度70%，活性在95%以上。細(xì)胞計數(shù)，調(diào)制NK細(xì)胞濃度6×105/ml。

1.3.3 靶細(xì)胞制備：K562是人類紅白血病細(xì)胞系，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗技術(shù)中心二部惠贈。在含有10%胎牛血清，青、鏈霉素各100U/ml的RPMI 1640，37℃，5%CO2溫育箱中培養(yǎng) 24h。 用完全RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌 1次，1000r/min離心 6min。用完全RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)細(xì)胞數(shù)為1×105/ml。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加K562細(xì)胞懸液100μl，每孔細(xì)胞數(shù)為 1×104。

1.3.4 在20%標(biāo)本血清作用下，NK細(xì)胞殺傷活性比較：取100μl NK細(xì)胞至細(xì)胞培養(yǎng)管中，每管6×104個NK。分別加重度子癇前期及正常妊娠血清40μl，每管加 RPMI-1640培養(yǎng)液至終體積 200μl，血清濃度為20%，培養(yǎng)20h后用PBS洗滌3次。

在K562細(xì)胞培養(yǎng)孔中（1×104）加效應(yīng)細(xì)胞2×104個 NK，效靶比為 2∶1。最終每孔體積 200μl。每個標(biāo)本作3個復(fù)孔。效靶細(xì)胞孵育4h。

1.3.5 不同濃度重度子癇前期患者血清對NK細(xì)胞殺傷活性影響：為了比較不同濃度重度子癇前期患者血清對NK細(xì)胞殺傷活性影響，實驗中同時做了10%及40%血清濃度組，方法同上。并將10%、20%、40%血清濃度組NK細(xì)胞殺傷活性進(jìn)行比較。設(shè)效應(yīng)細(xì)胞對照孔：2×104個NK細(xì)胞；靶細(xì)胞對照孔：1×104個K562細(xì)胞。

1.3.6 MTT法檢測NK細(xì)胞殺傷活性：培養(yǎng)板各孔加入 10μl MTT（5mg/ml）共同孵育 4h。孵育在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行。孵育結(jié)束后，棄上清，各孔加二甲基亞砜150μl，微型振蕩器振蕩10min，酶標(biāo)儀570nm波長處測A值。

1.3.7 NK細(xì)胞殺傷活性計算方法：取3個復(fù)孔A值的中間值，按下述方法計算NK細(xì)胞殺傷活性，以殺傷率（%）表示。NK細(xì)胞活性（%）=［1-（實驗組A值-效應(yīng)細(xì)胞組A值）/靶細(xì)胞組A值］×100。

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 重度子癇前期患者及正常妊娠婦女血清對NK細(xì)胞殺傷活性影響。

在用20%重度子癇前期患者及正常妊娠婦女血清孵育20h后，重度子癇前期組NK細(xì)胞殺傷活性為（48.68±8.47）%，正常妊娠組為（35.21±8.24）%。與正常妊娠組相比，重度子癇前期組NK細(xì)胞殺傷活性增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

2．2 不同濃度重度子癇前期患者血清對NK細(xì)胞殺傷活性影響

在10%、20%、40%濃度重度子癇前期患者血清作用20h后，10%血清濃度組NK細(xì)胞殺傷活性為（39.98±7.65）%，40%血清濃度組為（58.33±7.45）%。10%、20%、40%濃度重度子癇前期3組間兩兩相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=24.326，P<0.01）。

3 討論

近年研究表明，子癇前期患者外周血NK細(xì)胞中 IFN-γ 表達(dá)增多［5］，Wilczynski報道［6］子癇前期患者蛻膜中NK細(xì)胞比率增多，分泌IFN-Γ增多，而分泌IL-6、IL-10減少。張展等［7］報道子癇前期患者體內(nèi)NK細(xì)胞數(shù)量及功能均表現(xiàn)增強狀態(tài)，從而在妊娠過程中影響母胎免疫耐受。而NK細(xì)胞功能變化的具體機(jī)制尚不清楚。本研究中，在子癇前期重度患者血清下，NK細(xì)胞殺傷活性增強，且在10%、20%、40%血清濃度組，隨血清濃度的增加，NK細(xì)胞殺傷活性呈現(xiàn)增高趨勢，提示子癇前期患者血清中某些因子可能使NK細(xì)胞活性增強，子癇前期患者NK細(xì)胞功能變化可能與血清中某些因子有關(guān)。

子癇前期患者血清導(dǎo)致NK細(xì)胞活性增強可能存在以下幾個原因：（1）子癇前期胎盤淺著床，組織供血供氧不足，滋養(yǎng)細(xì)胞分泌細(xì)胞毒性因子入血，如TNF-α、IL-1等，蛻膜淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ水平升高［6］，子癇前期患者的血清中含有某種或某些胎盤源性細(xì)胞毒性因子，導(dǎo)致NK細(xì)胞活性增高；（2）子癇前期患者Th1/T h1細(xì)胞因子比例失衡。有實驗表明［8］，子癇前期患者外周血單個核細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ水平升高，分泌Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平下降。Dong等［9］研究發(fā)現(xiàn)子癇前期患者血清IL-2/IL-10TNF-a/IL-10比率與正常妊娠相比明顯升高，子癇前期患者血清中Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ等能促進(jìn)NK的活化和增殖，導(dǎo)致NK細(xì)胞功能的改變。

活化的NK細(xì)胞一方面損害胎盤組織，抑制滋養(yǎng)層的生長，另一方面又可能對血管內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷。NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的識別作用為非特異的，不受MHC限制，具有直接殺傷靶細(xì)胞的效應(yīng)。Kitayama等［10］證實IL-2激活的NK細(xì)胞不但對異體內(nèi)皮細(xì)胞，對自體內(nèi)皮細(xì)胞也有肯定的殺傷作用。

綜上，本研究結(jié)果顯示重度子癇前期患者血清可使NK細(xì)胞殺傷活性增強，提示子癇前期患者NK細(xì)胞功能變化與血清中某些因子有關(guān)。子癇前期患者血清中誘導(dǎo)NK細(xì)胞功能變化的確切因素尚有待于今后進(jìn)一步研究。

［1］Redman CW，Sargent IL.Immunology of pre-eclampsia ［J］.Am J Reprod Immunol，2010，63（6）：534-543.

［2］Yagel S.The developmental role of natural killer cells at the fetal-maternal interface［J］.Am J Obstet Gynecol，2009，201（4）：344-350.

［3］Wei J，Satomi M，Negishi Y，et al.Effect of sera on adhesion of NK cells to endothelium in severe preeclampsia ［J］.J Obstet Gynecol Re，2006，32（5）：443-448.

［4］樂杰.婦產(chǎn)科學(xué)［M］.7版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：92-99.

［5］Darmochwal-Kolarz D，Rolinski J，Leszczynska-Goarzelak B，et al.The expressions of intracellular cytokines in the lymphocytes of preeclamptic patients［J］.Am J Reprod Immunol，2002，48（6）：381-386.

［6］Wilczynski JR，Tchorzewski H，Banasik M，et al.Lymphocyte subset distribution and cytokine secretion in third trimester decidua in normal pregnancy and preeclampsia ［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2003，109（1）：8-15.

［7］張展，賈莉婷，常彩紅，等.先兆子癇患者母、臍血NK細(xì)胞增殖能力及殺傷功能測定［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2005，40（4）：688-691.

［8］魏軍，尚濤，王德志.妊娠高血壓綜合征患者外周血單個核細(xì)胞產(chǎn)生Th1、Th2型細(xì)胞因子失衡的研究［J］.中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2003，6（4）：195-198.

［9］Dong M，Wang Z，He J.Serum T helper 1-and 2-type cytokines in preeclampsia［J］.Inter J of Gynecol and Obstet，2005，89（3）：288-290.

［10］Kitayama J，Tsuno N，Yahuhara H，et al.Lysis of endothelial cells by autologous lymphokine-activated killer cells ［J］.Cancer Immunol Immunother，1994，38（5）：317-322.

（編輯武玉欣，英文編輯王又冬）

Effect of the Sera from Severe Preeclamptic Patients on Killing Ability of Peripheral Blood NK Cells

WEI Jun，YANG Zhi-ying，YANG Zai-xia，LIU Cai-xia
（Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo study the effect of the sera from severe preeclamptic patients on killing ability of peripheral blood NK cells.MethodsNK cells from healthy non-pregnant women were incubated with 10%，20%and 40%serum from severe preeclampsia patients and normal pregnant women for 20hours.The effect of the sera on NK killing ability to K562cells was analyzed by MTT method.ResultsIn 20%severe preeclamptic sera group，NK killing ability to K562cells ［（48.68±8.47）%］was significantly increased compared with that in normal pregnant group ［（35.21±8.24）%］（P<0.01）.The killing ability of NK cells was （39.98±7.65）%in 10%severe preeclamptic sera group，while （58.33±7.45）%in 40%severe preeclamptic sera group.There were significant differences among 10%，20%and 40%severe preeclamptic sera group （F=24.326，P<0.01）.ConclusionThe sera from severe preeclamptic patients might increase the killing ability of NK cells.

preeclampsia；NK cell；killing ability

R714.24

A

0258-4646（2011）02-0137-03

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0952.009

遼寧省博士啟動基金資助項目（20071054）

魏軍（1968-），女，副教授，博士.E-mail：weij@sj.hospital.org

2010-10-15