內源性一氧化氮合酶抑制劑與重編程功能性心肌干細胞

汪進益 綜述 范慧敏 劉中民 審校

干細胞再生醫學被視為繼藥物治療和外科手術后的第三代治療方法，在器官發育和組織修復中已凸現出非常重要的地位。然而，目前干細胞研究仍處于探索的早期階段，干細胞在發育、疾病和再生等方面的分子水平機制尚未闡明[1]。當今生物學關于體細胞重編程（Reprogramme）及細胞核潛在全能性的熱點研究，即誘導式多能干細胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）技術，對再生醫學和體外疾病模型的研究具有潛在的重要意義[2－3]，如從人類iPSCs可以產生“功能性心肌干細胞”（Functional cardiomyocytes），作為新生組織的來源而實現心肌再生[4]。但誘導產生iPSCs的效率低下，且重編程不完全，必須依賴轉基因的外源因子的持續表達[5]；利用病毒轉基因（尤其是癌基因c-Myc和Klf4）在體細胞基因組內整合后存在致癌危險[2，5]，從而限制了iPSCs在基礎研究、藥物篩選、毒理學及再生醫學等方面的應用[6-8]。有些學者認為，重編程后的細胞是否具有全能性，并不是必須的，一個具有一定分化能力，但是這種分化能力并非無限制的狀態可能更為安全和有效[9]。鑒于每種細胞都表達著一些決定它們分化狀態的基因，這一特征在細胞融合實驗中尤其明顯[10]。因此，鎖定在“單一多能性”或者“寡多能性”（只能產生一種或幾種細胞類型）的目標，通過外源表達基因進行體細胞重編程，轉換與所需細胞類型相近的一種正常細胞來產生所需的細胞類型（特定組織的功能性細胞）[11－12]，進而探索這些重編程干細胞在體內和體外增殖、分化及調控等微環境方面的基礎性研究，對深入研究干細胞分子機制更具有重要的實用意義。

1 重編程“功能性心肌細胞”

利用外源表達基因在轉錄因子激活或抑制的相互平衡條件下進行體細胞重編程，轉換為與所需細胞類型相近的一種正常細胞來產生所需的細胞類型[11-12]，并在一定誘導條件下（微環境）向特異性組織細胞（如心肌細胞）定向分化，而不是將細胞先轉變成全能性的狀態再從一個很大的范圍來縮小它們的分化道路，令重編程細胞的治療性使用更加安全和接近現實。迄今為止，重編程細胞的產生均通過重編程因子的核酸運載系統（如采用逆轉錄病毒載體、組成型的慢病毒載體及可誘導的慢病毒載體）獲得。因為有跡象表明，基因組的插入可能影響基因功能[13]，而病毒基因的重新激活則有可能導致腫瘤的發生[5]，因此整合型病毒僅適合于機理研究[14－15]。對整合位點的分析沒有發現共同的靶標和通路，這表明重編程過程中基因組的整合并不是必需的[16-17]。Zhou等[18]用腺病毒轉入三個通常為胰島β細胞分化所需的轉錄因子(Pdx1、Ngn3和MafA)后，將20%的成功轉染的外分泌細胞直接轉變成能產生胰島素的內分泌β細胞。攜帶外源基因的腺病毒不必整合到外分泌細胞的基因組當中，品系轉變并不需要細胞分裂，并且對外源基因表達的需求也是暫時的，為細胞的定向分化提供一條現實的可行性策略。因此，腺病毒轉運和瞬時轉染成功運用于細胞的重編程，使得最終運用瞬時轉運方法獲取重編程干細胞成為可能[19-21]。此外，選擇用何種組織細胞制備干細胞，主要是出于組織獲取途徑的安全性和可重復性，以及細胞重編程效率的考慮[22]。這就要求應用研究的重編程干細胞需要供體細胞具備容易獲取、含有較少的遺傳紊亂和容易被瞬時轉染方法重編程的特點[21]。由于分離成纖維細胞（Fibroblast，FB）在技術上十分簡便[23]，獲取容易，不僅可以與胚胎干細胞的培養條件兼容，還可以用作胚胎干細胞生長的飼養層細胞。因此，FB目前依舊是研究重編程過程機制時基礎研究的首選。運用細胞生物學和基因工程相結合的技術，通過肌肉轉錄調節因子 （Myogenic determination，MyoD）和連接蛋白 43（Connexin 43，Cx43）基因誘導分化，將FB改造成為具有縫隙連接介導細胞間通訊 （Gap junctional intercellular communication，GJIC）功能的可興奮細胞的“心肌樣”細胞（功能性心肌細胞）是可行的。

2 內源性一氧化氮合酶抑制劑系統的作用

無論在體內還是體外，細胞通常都是處于一種異質性（Heterogeneous）的環境當中，在移植之后會發生聚集和遷移，還會與宿主系統（如局部微環境和免疫系統等）發生相互作用[18]。因此，植入細胞所處的微環境具有重要作用[24]。臨床應用時，細胞所處的微環境往往都是病理狀態下的微環境，也可能是處于免疫抑制狀態下的微環境。急性心肌梗死時，活性氧化物（Reactive oxygen species，ROS）增高導致梗死心肌內環境處于持續氧化應激狀態，內因性血管形成能力低下，即使移植有可能向心肌細胞分化的干細胞也難以期待其功能的顯著恢復，干細胞移植入梗死心肌后存活率低，限制了其改善心肌梗死后的心功能和促進新血管生成（Angiogenesis）的作用。探討干細胞在體內和體外增殖、定向分化的微環境調控因素及其作用機制的理論，對實現高效地將重編程干細胞定向分化為心肌細胞，并應用到心肌再生具有重要的理論價值。化學修飾小分子調節劑、轉錄因子及輔助因子等應答發育或環境信號來控制細胞類型特異性基因的表達，從而誘導細胞的定向分化[25－26]，形成可供臨床使用的重編程體細胞[1]。已有的研究證實，小分子化學物質一氧化氮（Nitric oxide，NO）是由一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS）以左旋精氨酸（Larginine，L-arg）和分子氧為底物形成，在心肌梗死后心室重構與心力衰竭的病理生理進程中起重要作用[27]。Long等[28]報道，外源性L-arg的補給可以影響內皮細胞NOS活性，促進內源性NO的生成，對成肌細胞的誘導分化和融合（肌管形成）發揮直接作用，而這一作用可被NOS抑制劑亞硝酸左旋精氨酸甲酯 （NG-Nitro-L-arginine Methyl Ester，LNAME）阻斷。NOS增強劑（AVE9488）通過調節內皮細胞的NOS過表達和增加NO的合成，緩解血管舒縮功能障礙、超氧化物形成、增加循環中內皮祖細胞，達到改善心肌重構和心功能的作用[29]。非對稱型左旋二甲基精氨酸（Asymmetric dimethylarginine，ADMA）是機體自身產生的NO合成底物L-arg的類似物，能競爭性抑制NOS的活性，使NO合成減少，被稱為內源性一氧化氮合酶抑制劑 （Endogenous inhibitor of nitric oxide synthase）。ADMA的代謝是經二甲精氨酸-二甲賴氨 酸 水 解 酶 （Dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH）的作用生成二甲胺及L-瓜氨酸（較穩定，測定其水平可以反應DDAH的活性）[30]。DDAH的表達上調或活性增加均可使ADMA的代謝增強；反之，DDAH的表達下調或活性減弱使ADMA分解代謝減弱，使ADMA蓄積。雖然ADMA濃度升高的分子機制尚未完全闡明，但是仍有充分的證據表明ADMA可通過下調Cx43基因的表達，抑制內皮細胞細胞之間GJIC的功能[31]；機體ADMA水平的減少可以促進骨髓源內皮細胞動員，加速血管的形成[32]。研究表明，內源性一氧化氮合酶抑制劑系統 （ADMA/DDAH途徑）是血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）介導內皮細胞能動性和血管生成的決定性因素，其中其改變NO信號和Rho GTPases酶（肌動蛋白活性的關鍵性調節因子）活性是核心作用[33-35]。因此，內源性一氧化氮合酶抑制劑系統（ADMA/DDAH）不但在體內外調控血管生成中起著關鍵性作用，而且對肌細胞的誘導分化和促進肌生成方面發揮重要作用。所以，通過藥物等方式調節ADMA濃度是心血管疾病的一個新的治療目標，需要進一步研究其生理和病理生理作用及機制。

綜上所述，探索研究ADMA/DDAH系統對重編程獲得的“功能性心肌細胞”之間、宿主心肌組織內及其與血管內皮細胞間相互作用的可塑性（心肌定向分化）干預作用，可以豐富移植細胞與微環境和諧共存下干細胞定向分化的分子機制。

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