胰腺癌血清Periostin水平與淋巴結轉移的關系

劉 宇 劉保安 (中南大學湘雅基礎醫學院病理學系，湖南 長沙 410078)

胰腺癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，多發生于胰頭部。腹痛及無痛性黃疸為胰頭癌的常見癥狀。癌腫轉移在早期即可出現，對于胰腺癌臨床又缺乏早期診斷的有力手段，采用手術切除方式只有10%～15%的病人在確診后可以根治性切除，況且腫瘤患者5年存活率也只有5% ～20%〔1〕。胰腺癌淋巴結轉移對于手術治療和預后是至關重要的因素。近年來發現，Periostin(PN)的過表達與腫瘤的惡性程度、侵襲性和轉移性有密切關系〔2，3〕。本文將利用ELISA技術探討胰腺癌血清PN水平與淋巴結轉移的相關性。

1 資料與方法

1.1 試劑與設備 人PN重組蛋白、兔抗人PN mAb、兔抗人PN pcAb、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(IgG-HRP)和牛血清白蛋白(BSA)(R＆D 公司)，3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺(上海江萊生物科技有限公司)。雷勃MK3 Multiskan酶標儀、THERMO Wellwash 4 MK2全自動洗板機(Thermo公司，芬蘭)。

1.2 標本采集 所有受試者均根據診斷標準進行確診，并分組處理，診斷依據:(1)臨床表現為腹痛、黃疸和消瘦;(2)實驗室檢查:①一般血清生化學檢查;②胰腺癌血清學標記物免疫學檢查:具體包括:糖鏈抗原19-9(CA19-9)，癌胚抗原(CEA)，胰胚抗原(POA)、胰腺癌特異抗原(PaA)及胰腺癌相關抗原(PCAA)檢測指標;③影像學檢查:B超、CT、磁共振成像(MRI)進行胰腺癌普查、篩選、診斷、確診，以供分組。檢查結果其中健康成人31例(自愿健康體檢者)，胰腺癌患者18例和有遠處轉移的胰腺癌患者18例，采集67例受試者的血清樣本，收集血清后，迅速離心10 min，－20℃保存備用。

1.3 ELISA方法

1.3.1 操作 首先采用棋盤滴定法確定最佳濃度，結果表明:在包被抗體濃度1.0 μg/ml，檢測抗體濃度1∶1 000比例時，標準曲線線性關系佳。具體操作:(1)將兔抗人PN mAb稀釋1∶1 000后，包被酶標板，在4℃中，包被48 h，用3%BSA 進行封閉;(2)在37℃溫度下，加入1%磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋的人PN重組蛋白標準品使其作用1 h;(3)再加入經1%PBS稀釋的1∶1 000 PN pcAb，4℃環境過夜，然后再放置室溫1 h;(4)加入經1%PBS稀釋的1∶1 500羊抗兔IgG-HRP，37℃恒溫箱顯色15 ～30 min 后，讀記吸光度 A450 值〔3，4〕。

1.3.2 鑒定檢測與PN檢測分析 先以兔抗人PN mAb包被酶標板，分別加入白介素6(IL-6)、血管內皮細胞黏附分子-1(VCAM-1)、生長激素(GH)和促腎上腺皮質激素(ACTH)，測定A450值并與陰性對照比較。如果PN測值為0或很低，提示血清中IL-6、VCAM-1、GH和ACTH抗原對PN的檢測影響很小，試劑盒的特異度較強〔4，5〕。PN ELISA 試劑盒分別測定 31例健康成人，18例胰腺癌患者和18例有淋巴結轉移的胰腺癌患者的血清PN，以PN蛋白濃度為橫座標，以A450平均值為縱座標，繪制標準曲線。標準曲線由分析軟件處理。

1.4 統計學分析 采用SPSS18.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗。

2 結果

2.1 標準曲線靈敏度和特異性評價 取3份已知濃度的標準品，進行批內和批間變異系數分析。分析結果顯示:試劑盒的試驗內變異系數平均為7.6%，均小于10%;試驗間變異系數平均為13.15%，均小于15%。在不同PN濃度的PN蛋白標準液，用已建立的ELISA方法測得的回收率在82% ～92%之間，平均回收率為89.6%。標準曲線方程式曲線擬合度R2=0.968。線 性 范 圍 為 4.903～500 ng/ml。靈 敏 度 為4.903 ng/ml。在加入 IL-6、VCAM-1、GH 和 ACTH 后測 A450值，與陰性對照孔的A450值比較，無顯著性差異，無統計學意義(P＞0.05)，提示PN蛋白與這些物質均無交叉反應，試劑盒的特異度較強。

2.2 檢測結果 健康對照者31例的血清PN含量為(22.0±6.8)ng/ml，分布呈正態，以血清濃度＜35.60 ng/ml為正常界值。18例胰腺癌患者的血清PN含量為(37.9±20.9)ng/ml，18例有淋巴結轉移的胰腺癌患者的血清PN含量為(45.6±25.8)ng/ml。胰腺癌患者與健康對照者間差異具有統計學意義(P＜0.05)。而18例胰腺癌患者與健康對照者和18例有淋巴結轉移的胰腺癌患者之間均有顯著性差異(P＜0.05)。

3 討論

PN過表達與惡性腫瘤惡性程度相關，PN與整合素結合并相互作用參與腫瘤發展，同時通過整合素和(或)EGF信號途徑促進癌細胞侵襲轉移。有研究表明，PN在促進癌細胞生存中起重要作用，并提出了其抗體可能是有效的治療藥物的假設。PN在腫瘤血管生成、轉移瘤生長中起關鍵作用〔6，7〕。

由于腫瘤轉移容易導致抗癌治療失敗和患者死亡〔8〕，而轉移相關基因被認為是早期預測惡性腫瘤生物學行為的關鍵。大量研究發現，PN基因就是腫瘤轉移候選基因之一，具有促進晚期腫瘤進展的作用;PN蛋白過表達與腫瘤轉移和預后不良具有很好的相關性〔9〕。然而胰腺癌腫瘤誘導PN細胞因子的分子機制尚不明確，PN如何促進癌細胞生長和生存機制也尚需進一步研究。可是，本文實驗研究發現，胰腺癌患者的PN蛋白水平明顯高于健康正常人，而有淋巴結轉移的胰腺癌患者其PN蛋白水平明顯高于胰腺癌患者，這些都證實了PN與腫瘤轉移有密切關系。因此，PN蛋白水平的檢測可以用于判斷胰腺癌和作為診斷胰腺癌是否出現淋巴結轉移的指標。

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