人肝癌SMMC-7721細胞培養體會①

王玥 李應東

(甘肅中醫學院 蘭州 730060)

目前細胞培養技術已成為很重要的生物技術之一,它是醫學、新藥開發等實驗研究的基礎技術,其作用不容忽視。人肝癌SMMC-7721細胞屬于肝癌細胞系,現已廣泛用于藥物毒理、抗腫瘤等方面的研究,目前關與人肝癌SMMC-7721細胞的培養文獻還比較少,我們對于人肝癌SMMC-7721細胞的培養條件和方法上進行了探索,現總結出一些經驗。

1 資料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實驗細胞 人肝癌SMMC-7721細胞株由甘肅蘭州大學附屬二院泌尿研究所惠贈。

1.1.2 主要試劑 Dulbcco’s Modified Eagle’Medium(DMEM)培養基:北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司磷酸鹽緩沖液(PB S):氯化鈉8.00g、十二水磷酸氫二鈉2.885g、氯化鉀0.20g、磷酸氫二鉀0.20、三蒸水配制,0.22μm濾膜過濾除菌,PH7.2～7.4,4℃保存。新生牛血清(NBCS):杭州四季青生物材料工程研究所-20℃保存,使用前4℃溶解,56℃滅活30min。胰蛋白酶消化液:胰蛋白酶(T rypsin 1:250,GIBCO公司)用PBS液配制成濃度為0.25%溶液,0.22μm濾膜過濾除菌,4℃保存。青霉素、鏈霉素溶液:0.22μm濾膜過濾除菌,4℃保存。

1.1.3 實驗儀器 二氧化碳培養箱:BB16UV德國Heraeus公司;超凈工作臺:VS-1300L型,蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限責任公司;倒置相差光學顯微鏡:IX71型,日本Olympus公司產品;恒溫水浴鍋:DZW-4型,金壇市恒豐儀器廠;純凈水系統:Milli-Q Biocel美國Millipore公司;電熱恒溫干燥箱:風熱式,101型,北京科偉永鑫實驗儀器設備廠;臺式滅菌器:TMQ.J-2540型,山東新華醫療器械股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SMMC-7721細胞的復蘇方法 將凍存的細胞用鑷子捏住在提前預熱的37℃水浴鍋中快速搖晃將細胞解凍,整個過程一般不要超過2min,然后將細胞用尖吸管轉移至細胞培養瓶中(復蘇的時候細胞最好不要分瓶),密度一般為1×104cell/mL為宜。緩慢加入8～10倍體積的含10%胎牛血清[1]、雙抗溶液(濃度一般保持0.1%)的DMEM培養基(含4.0mm L-谷氨酰胺、1000mg/L葡萄糖、110mg丙酮酸鈉經0.1μm無菌過濾)進行稀釋,用尖吸管吹打50次將細胞吹散,培養瓶經酒精擦拭就可以放入5%CO2、37℃細胞培養箱中培養。剛復蘇的細胞比較脆弱在復蘇的24h內最好不要觀察,以免晃動影響細胞貼壁。24h后一般大多數貼壁細胞已經貼壁,這時一定要換成新鮮的培養液,不然凍存液中的DMSO會對細胞造成損傷,在我們的實驗中發現48h后不除去DMSO會使SMMC-7721細胞喪失原來的細胞形態變圓從而停止生長。

1.2.2 SMMC-7721細胞的傳代方法 細胞一般鋪滿瓶底80%左右就可以進行傳代了。SMMC-7721細胞形態一般為花瓣狀,如果細胞數目過多未及時傳代可以觀察到細胞分為2層:上層為圓形細胞層,下層為花瓣形細胞層。我們實驗室采用的傳代的具體方法如下:先用已過濾的預冷PBS溶液洗細胞2次,再加入0.25%的胰酶溶液1mL來回輕晃培養瓶用封口膜封口后在顯微鏡下觀察,待大部分細胞變圓后(一般2min左右)立刻豎起培養瓶使細胞脫離胰酶溶液,經酒精擦拭拿回超凈臺,用尖吸管將胰酶吸出(此時盡量不要直接倒掉胰酶因為細胞經消化已經貼壁不牢了,直接倒掉會損失一部分細胞)。最后根據你要傳的瓶數加入相應的培養基用尖吸管吸取培養基從培養瓶爬滿細胞的那面由上往下吹打。我們一般采取1∶3的傳代方式,細胞生長良好,3d后長滿瓶底。

1.2.3 SMMC-7721細胞的凍存方法 在細胞生長良好的時期一般為對數生長期我們要對細胞進行凍存,如果實驗中出現污染可以提供健康的細胞來源。下面來談談凍存的方法:凍存前首先我們要配置凍存液,我們采用的凍存液的比例是1mL的凍存液中含0.5mL的血清、0.4mL的新鮮培養基、0.1mL的DMSO。剛配制的凍存液不能直接加入細胞內,因為DMSO會釋放出大量的熱會對細胞產生損傷。具體方法如下:將生長良好的SMMC-7721細胞(約為80%～90%致密度,濃度為1×105cell/mL)先用PBS溶液洗2次,用0.25%的胰酶如前面所述的方法將細胞從瓶壁上消化下來移入離心管中800轉離心5min,用尖吸管吸去上清,加入已配置好的凍存液,最后將細胞吹散移入凍存管中封口、標記好細胞的種類及凍存日期,先放入4℃冰箱10min再轉入-20℃30min,然后放入-80℃冰箱過夜,最后取出放入液氮槽中長期貯存。如果實驗室沒有液氮罐,可以在4℃冰箱放30min轉入-20℃2h最后放入-80℃冰箱,這樣貯存方法可以貯存半年左右。凍存后的細胞經過一段時間可以拿出來復蘇一瓶,觀察細胞的生長情況。

2 討論

2.1 復蘇是否采用離心的方法

有些文獻[2]報道細胞復蘇時采用用離心的方法去掉凍存液,鑒于剛復蘇的細胞很脆弱離心會對細胞產生一定的損傷,故認為復蘇時不離心,第2天換液為佳,因為10%的DMSO短期并不會對細胞造成影響,經此方法復蘇的SMMC-7721細胞存活率較高一般達80%以上。

2.2 消化方法的改進

消化時如果單純用胰酶消化時間很難把握,若消化過度,細胞不容易貼壁,48h后仍不貼壁示為死細胞。若消化不完全用尖吸管吹打細胞很難吹下細胞。長時間吹打也會對細胞造成損傷,這樣傳代還會引起每瓶細胞數目不均一,用PBS洗后消化時間易于掌握,提高細胞的活力。

2.3 凍存液的配制方法改進

以往相關資料中[3]報道凍存液里含90%的培養液(含血清20%)和10%的DMSO,由于細胞凍存會使細胞變的脆弱活力下降,應當加大血清的含量以保證復蘇后的細胞活力較好,復蘇的成功率較高,目前也有學者采用90%的血清加10%的DMSO配成凍存液認為這樣供給細胞更多的營養會更利于復蘇后細胞的成活。

2.4 復蘇后細胞不貼壁的原因分析

復蘇后的貼壁細胞24h后80%以上的細胞都會貼壁,不貼壁的細胞可能已經死亡,主要有以下3方面的原因:(1)凍存前的細胞已經存在污染;(2)凍存方法不正確主要可能是加入血清過少或者凍存溫度時間錯誤;(3)細胞復蘇時離心時間過長轉速過高或細胞貼壁后未及時去除凍存液從而對細胞造成損傷。

一般SMMC-7721細胞在復蘇后4d左右貼壁率達90﹪以上,就可進行傳代,傳代后的細胞生長較迅速,3d左右基本可以鋪滿瓶底,經過2、3次傳代細胞穩定后,生長狀態良好時就可以對細胞進行臨床毒理性試驗研究、細胞核型分析、及提取總蛋白進行蛋白印記分析等各種操作。

3 總結

在人肝癌SMMC-7721細胞培養過程中最為關鍵的技術還是無菌操作,一切的步驟都建立在其基礎之上。對培養過程中所接觸的試劑、液體、器皿、均要進行嚴格的消毒,無菌觀念要貫穿整個實驗的始終,不可松懈。

[1]張卓然.實用細胞培養技術[M].北京:人民衛生出版社,1999:11～27.

[2]唐孟萱,周萬軍,胡元佳,等.HepG2細胞培養方法與條件的探索[J].實用預防醫學,2005,12(1):71～73.

[3]李燕,張鍵,于江天.細胞與分子生物學常用實驗技術[M].西安:第四軍醫大學出版社,2009:7.