非小細胞肺癌患者手術治療前后外周血Th1、Th2、Th17細胞水平變化

郭鴻超,李 卉,龐作良＊

(1新疆醫科大學附屬腫瘤醫院,烏魯木齊 830011;2新疆醫科大學基礎醫學院)

肺癌的發生、發展及預后與機體的免疫功能狀態密切相關。輔助性T淋巴細胞(Th)是CD+4T細胞的主要亞群,根據其分泌的細胞因子不同可分為Th1、Th2、Th17三個亞群,分別在抗腫瘤免疫、腫瘤免疫逃避和耐受機制、腫瘤免疫微環境和機體免疫穩態中發揮重要作用。2010年 7～11月,我們觀察了非小細胞肺癌(NSCLC)患者根治性手術治療前后外周血Th1、Th2、Th17細胞水平的變化,并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 NSCLC患者27例,男18例,女9例;年齡 30～70歲。有淋巴結轉移 12例,無淋巴結轉移15例;組織分類為鱗癌16例,腺癌11例;組織分化程度為高分化 5例,中分化 15例,低分化 7例; UICC分期ⅠA期2例,ⅠB期4例,ⅡA期3例,ⅡB期 11例,ⅢA期 7例。患者均行肺癌根治性手術,術后常規病理檢查確診。標本采集前未行化療、放療及免疫治療等。

1.2 Th1、Th2、Th17細胞檢測方法 于術前3 d和術后14 d清晨空腹狀態下留取患者肘靜脈血5 ml,肝素鈉抗凝,1 h內開始預處理。①刺激培養：取抗凝混勻全血1m l+含10%胎牛血清的RPMI1640液1m l+BFA 10μl/ml+PMA 20 ng/m l+離子霉素1 μg/ml,吹打混勻,5%CO2、37℃孵育5 h。②胞外染色：將刺激培養的標本分為 3管,各 500μl,用 PBS洗1遍,1 200 r/min離心5min,吸上清。每管加PEcy7-anti-CD4抗體10μl,振蕩混勻,室溫避光15 min。③溶血及破膜：每管加10倍稀釋的FACS溶血素2ml,室溫避光10 min。1 500 r/min離心5 min棄上清。1%多聚甲醛固定細胞,各管加 10倍稀釋的FACS通透劑0.5 ml,室溫避光10 min,加PBS 2 ml,1 500 r/min離心5 min棄上清。④胞內染色：設1管為對照管,加同型對照FITC-anti-IgG2a/PE-anti-IgG1抗體10μl;余2管為試驗管,分別加抗體FITC-anti-IFN-γ/PE-anti-IL-4、PE-anti-IL-17各10μl,混勻后室溫避光30min。每管加1%多聚甲醛 500μl,流式細胞儀檢測。⑤結果判讀：在Cell Quest軟件下獲取1萬個細胞,FACSCaliber型流式細胞儀測定淋巴細胞胞內和胞膜各種熒光素的熒光強度。用PEcy7標記的CD4單抗和側向角散射光雙參數圈出CD4陽性細胞群,空白對照和陰性對照消除自發熒光和非特異熒光,Dot2 Plot點圖測算Th1(CIFN-γ+)、Th2(CIL-4+)、Th17 (CIL-17+)細胞百分比。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。正態分布的計量資料比較用自身配對 t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

27例NSCLC患者手術治療前后外周血Th1、Th2、Th17細胞水平比較,見表1。

3 討論

表1 27例NSCLC患者手術治療前后外周血Th1、Th2、Th17細胞水平比較(±s)

表1 27例NSCLC患者手術治療前后外周血Th1、Th2、Th17細胞水平比較(±s)

注：與術前相比,＊P＜0.05,△P＜0.01

觀察時間 Th1(%) Th2(%) Th1/Th2 Th17(%) Th/CD+ 4術前 24.47±10.34 22.16±9.98 1.58±1.44 1.68±1.10 47.30±10.52術后 27.91±7.06 12.39±7.84△ 5.44±13.26 1.12±0.46＊ 42.86±10.29

在腫瘤發生發展的整個過程中,免疫系統既可對抗腫瘤細胞,又有利于腫瘤細胞逃避宿主免疫系統的攻擊[1]。Th1主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β等效應因子,介導細胞免疫應答,是機體抗腫瘤免疫的主要形式。Th2以分泌IL-4、IL-6、IL-10為主,主要介導體液免疫應答。正常情況下兩者處于相對平衡狀態。當Th1/Th2平衡偏向其中一方,即為“Th1 /Th2平衡漂移”,可能造成人體細胞因子網絡的動態平衡被破壞,進而引起許多疾病。Yamamura等[2]發現,基底細胞癌變部位Th2型反應增強,而良性腫瘤則以 Th1型反應為主。乳腺癌[3]、肺癌[4]、上皮性卵巢癌[5]等腫瘤中 Th1及其相關因子表達減少, Th1/Th2降低以及Th1向Th2飄移,使機體處于免疫抑制狀態。本研究表明,NSCLC患者術前外周血Th2呈優勢表達,術后Th2表達明顯減弱,而Th1在術后表達較術前稍有增加。說明肺癌患者手術后抗腫瘤免疫功能并未增強。Ito等[6]研究發現,肺癌患者外周血Th1/Th2明顯降低的患者比Th1/Th2正常者更容易出現術后復發。因此,對術后Th1/Th2較低的肺癌患者給予 Th1型細胞因子治療,可能對減少術后復發以及改善長期預后有益。

Th17細胞以分泌IL-17為主,其在腫瘤免疫中的作用尚存在爭議。有研究表明,腫瘤細胞高表達IL-1β、IL-6、IL-8、干擾素誘導蛋白-10(IP-10)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)和血管內皮生長因子(VEGF)等細胞因子,對Th17細胞在腫瘤微環境中的分化起著重要的促進作用[7,8]。本研究中,NSCLC患者手術治療后外周血Th17細胞較手術前明顯降低,表明腫瘤負荷時Th17細胞高表達。抑制Th17細胞的高表達有可能成為肺癌免疫治療的新靶點。

綜上所述,根治性手術治療后NSCLC患者的免疫抑制狀態有一定改善,但并不伴有抗腫瘤免疫的增強。因此,NSCLC患者術后應給予免疫支持治療,進一步糾正Th1/Th2的失衡,這對重建機體免疫功能具有重要意義。

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[2]Yamamura M,Modlin RL,Ohmen JD,et al.Local expression of antiinflammatory cytokines in cancer[J].JClin Invest,1993,91 (3)：1005-1010.

[3]徐淑芹,黃興富,范華.乳腺癌患者Th1/Th2型細胞因子的表達及臨床意義[J].山東醫藥,2008,48(28)：72-73.

[4]黃萍萍,唐德燊,吳平.肺癌患者Th1/Th2細胞因子的免疫反應狀態變化及臨床意義[J].實用醫技雜志,2007,14(13)：1657-1658.

[5]袁少洋,王愛麗,龐啟貞.上皮性卵巢癌患者外周血Th1/Th2細胞因子表達水平的變化[J].第四軍醫大學學報,2008,29(17)：1625-1627.

[6]Ito N,Nakamura H,Tanaka Y,et al.Lung carcinoma：analysisof T helper type 1 and 2 cells and T cytotoxic type 1and 2 cells by intracellular cytokine detection with flow cytometry[J].Cancer,1999, 85(11)：2359-2367.

[7]Yamazaki K,Yano T,Kameyama T,et al.Clinical significance of serum Th1/Th2 cytokines in patients with pulmonary adenocarcinoma[J].Surgery,2002,131(Suppl 1)：236-241.

[8]Miyahara Y,Odunsi K,Chen W,et al.Generation and regulation of human CIL-17-producing T cells in ovarian cancer[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(40)：15505-15510.