牛磺酸有關物質檢查的方法研究及質量考察

(北京市藥品檢驗所，北京 100035)

牛磺酸(taurine)化學名為2－氨基乙磺酸(2－aminoethansulfonic)，是一種具有多種生理功能的含硫氨基酸，主要用于治療感冒、發熱、神經痛、扁桃體炎、支氣管炎、風濕性關節炎、各類眼疾及藥物中毒。其為2005年版《中國藥典(二部)》收載品種[1]，在第31版美國藥典和日本藥局方(15版)中也已收載。但2005年版《中國藥典(二部)》牛磺酸標準中無有關物質檢查項。為進一步提高質量標準水平，確保對原料藥質量的監控，應建立牛磺酸有關物質檢查方法。由于牛磺酸無紫外吸收，無法用高效液相色譜法測定其有關物質，筆者參照第31版美國藥典和日本藥局方(15版)牛磺酸項下有關物質的檢測方法，用薄層色譜(TLC)法為牛磺酸原料建立了有關物質檢查方法，并考察了國內產品的質量，為2010年版《中國藥典》中牛磺酸質量標準的制訂提供了科學依據。

1 儀器與試藥

薄層色譜全自動點樣儀(瑞士Camag);Digistore 2數碼相機系統(瑞士Camag);AE240型天平(瑞士Mettler)。牛磺酸、丙氨酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號分別為111616－200301和140680－200401);牛磺酸原料藥(市售國產品，批號分別為TP08042365，TP08042366，TP06061029，TP0609004，TP0609005，TP0609006，070702，080301，080302);正丁醇(色譜純，Sigma 公司);冰醋酸、無水乙醇、丙酮(分析純，北京化學試劑公司);茚三酮(Fluka公司);硅膠G薄層預制板(青島海洋化工廠、煙臺化學工業研究所及Merck公司)，純化水。

2 方法與結果

2.1 溶液配制

精密稱取牛磺酸0.5 g，置25 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成20 g/L的溶液作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1 mL，置500 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，制成含牛磺酸40 μg/mL的溶液，作為對照溶液。分別取牛磺酸和丙氨酸對照品適量，分別用水溶解并稀釋成2 g/L的溶液，各取適量，等體積混合，搖勻，作為系統適用性試驗用溶液。

取于105℃下加熱1 h的樣品約1.0 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為高溫破壞樣品。取牛磺酸樣品約1.0 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液A。精密量取供試品溶液A10 mL，置50 mL容量瓶中，加1 mol/L的氫氧化鈉溶液10 mL，在100℃水浴中加熱1 h，放冷，調pH至中性，加水至刻度，搖勻，作為強堿破壞樣品。精密量取供試品溶液10 mL，置50 mL容量瓶中，加1 mol/L的鹽酸溶液10 mL，在100℃水浴中加熱1 h，放冷，調pH至中性，加水至刻度，搖勻，作為強酸破壞樣品。精密量取供試品溶液10 mL，置50 mL容量瓶中，加30%過氧化氫溶液10 mL，在100℃水浴中加熱1 h，放冷，加水至刻度，搖勻，作為氧化破壞樣品。

2.2 展開劑選擇及系統適用性試驗用溶液確定

采用高溫、強酸、強堿、強氧化方法對牛磺酸進行破壞性處理，希望能獲得強制降解產物。使用3種展開劑展開劑[A為正丁醇－冰醋酸－ 水(5∶1∶2)，B 為正丁醇－ 冰醋酸－ 水(60∶20∶20)，C 為水－無水乙醇－正丁醇－冰醋酸(150∶150∶100∶1)]分別考察分離效果，使用4種顯色方法[顯色方法Ⅰ為茚三酮的丙酮溶液(1→50)，Ⅱ為茚三酮 0.2 g溶于100 mL的正丁醇－2 mol/L醋酸(95∶5)，Ⅲ為茚三酮0.3 g溶于100 mL的正丁醇再加3 mL冰醋酸，Ⅳ為碘蒸氣]檢視其降解產物。結果表明，在較強的降解條件下，用上述方法均未檢出雜質斑點。顯示牛磺酸可能具有很好的化學穩定性，也有可能此TLC法只適用于檢測含有氨基的物質，若強制降解產物不含氨基，則無法檢出。為研究牛磺酸原料強制降解后含量變化，又使用丹磺酰氯對牛磺酸未破壞樣品及各降解產物進行柱前衍生，采用高效液相色譜法測定其含量，結果4種降解產物與未破壞樣品相比含量并無下降，說明牛磺酸原料非常穩定，在強制降解條件下并沒有生成其他有關物質。

由于無法選擇強制降解溶液作為系統適用性試驗用溶液，故考慮用雜質加入法配制系統適用性試驗溶液。目前國內各廠家產品工藝不同，引入的雜質也不同，無法統一雜質對照品，只能選擇與牛磺酸在同一TLC條件下比較難分離的化合物，作為其系統適用性分離對照品。丙氨酸分子的大小、性質與牛磺酸較接近，在同一條件下的TLC行為較相似，且其易得、無毒。因此，用牛磺酸與丙氨酸的等濃度混合溶液作為系統適用性試驗用溶液較適宜。

用3種展開體系分別對酸降解溶液、堿降解溶液、氧化降解溶液、高溫降解溶液及牛磺酸與丙氨酸的混合溶液進行展開，見圖1，分離情況見表1。結果顯示，C展開劑的分離能力優于A和B，因此選C展開劑較好。

圖1 采用3種展開劑的薄層色譜圖

表1 3種展開劑的分離情況

2.3 檢視方式選擇及最低檢出限確定

表2為4種顯色方法的對比。除碘蒸氣的檢測靈敏度明顯較低外，其他3種顯色劑的檢測靈敏度差異不大。因此，選用茚三酮的丙酮溶液(1→50)顯色即可。精密量取供試品溶液0.5，1.0 mL，分別置500 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含牛磺酸 20 μg/mL 和40μg/mL 的溶液。精密量取供試品溶液 1.0，2.0，3.0，4.0 mL，分別置 200 mL 量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含牛磺酸 100，200，300，400 μg/mL 的溶液。使用展開劑Ⅲ，點樣量5 μL，條帶狀點樣，點樣寬度3 mm。見圖 2。

圖2 最低檢出限薄層色譜圖

2.4 點樣方式考察

供試品溶液配制質量濃度較高(20 g/L)，點樣量較大，否則自身對照溶液色譜不易出現斑點;又因樣品溶解度而不能選用較易揮發的有機溶劑作為供試品溶液配制用溶劑，只能以水作為溶劑。因此，當點樣量為5 μL，采用圓點狀方式點樣時，供試品溶液色譜斑點易出現拖尾現象(見圖3)。后采用條帶狀方式點樣，拖尾現象大為改觀(見圖4)。

2.5 溶液穩定性考察

配制供試品溶液，室溫放置，于 0，2，4，8，24 h 檢測。結果各溶液色譜斑點顏色、大小均無明顯變化，且均無雜質斑點出現，表明供試品溶液在24 h內穩定。

表2 4種顯色劑的對比

圖3 9批樣品的薄層色譜圖

圖4 3批樣品的薄層色譜圖

2.6 擬訂方法

精密吸取供試品溶液(20 g/L)、對照溶液(40 μg/mL)、系統適用性試驗用溶液(1 g/L)各5 μL，分別以條帶式點樣方式點于同一硅膠薄層板上，條帶寬度5 mm，以水－無水乙醇－正丁醇－冰醋酸(150∶150∶100∶1)為展開劑展開，晾干，噴以茚三酮的丙酮溶液(1→50)，在105℃下加熱約5 min至斑點出現。系統適用性試驗用溶液應能檢出兩個斑點，供試品溶液的雜質斑點不得多于1個，且其斑點大小和顏色不得過對照溶液的主斑點(0.2%)。

3 討論

本試驗參照第31版美國藥典和日本藥局方(15版)的檢測方法，用薄層色譜法為牛磺酸原料建立了有關物質檢查方法。用擬訂方法考察國內兩種不同工藝生產的9批牛磺酸原料，均無雜質檢出，顯示國內產品純度很高、質量優異。此方法簡便靈敏，能有效檢測牛磺酸中有關物質。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:化學工業出版社，2005:49.