正交試驗(yàn)法優(yōu)選三七止血貼中三七的提取工藝研究

姚少毅，葉茂清，張潮林，廖華衛(wèi)

(1.中山大學(xué)附屬博濟(jì)醫(yī)院，廣東 廣州 511300; 2.廣東省四會市人民醫(yī)院，廣東 肇慶 526200;3.深圳萬和制藥有限公司，廣東 深圳 518057; 4.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

正交試驗(yàn)法優(yōu)選三七止血貼中三七的提取工藝研究

姚少毅1，葉茂清2，張潮林3，廖華衛(wèi)4

(1.中山大學(xué)附屬博濟(jì)醫(yī)院，廣東 廣州 511300; 2.廣東省四會市人民醫(yī)院，廣東 肇慶 526200;3.深圳萬和制藥有限公司，廣東 深圳 518057; 4.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目的 優(yōu)選三七止血貼中三七藥材的最佳提取工藝。方法 采用正交試驗(yàn)法，以提取液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的總含量為指標(biāo)，優(yōu)選藥材的提取工藝。結(jié)果 藥材較優(yōu)的提取工藝為加70%的乙醇8倍，提取3次，每次0.5 h。結(jié)論 優(yōu)選的提取工藝三七總皂苷提取率高，操作簡便，適用于生產(chǎn)。

三七止血貼;正交試驗(yàn)法;人參皂苷Rg1;人參皂苷Rb1;三七皂苷R1

三七有著悠久的應(yīng)用歷史，在《本草綱目》之前的《醫(yī)門秘旨》、跌損妙方》已有記載，歷代本草中多有收載，是我國最早的藥食同源植物之一。三七是五加科多年生草本植物三七 Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen 的根，味甘、微苦，性溫，歸肝、胃經(jīng)，以根、根狀莖入藥，功效能化瘀止血、活血定痛。《本草綱目》載“三七近時(shí)始出，南人軍中用為金瘡要藥，云有奇功”“乃陽明厥陰血分之藥，故能治一切血病”。三七為血證要藥，民間稱之為“止血金不換”“止血神藥”，止血而不留瘀，被廣泛應(yīng)用于各種出血性疾病的治療[1]。《本草新編》說:“三七根，止血神藥也。無論上、中、下之血，凡有外越者，一味獨(dú)用亦效。”現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)[2]，三七含達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜皂苷的活性成分，主要為人參皂苷 Rb1，Rb2，Rg1，Rg2等，及三七皂苷R1，R2，R3，且含氨基酸、黃酮類(槲皮素)等，水溶性部分止血有效成分為田七氨酸。筆者以創(chuàng)新劑型、提高臨床療效、改善患者用藥順應(yīng)性為目的，對三七止血貼中三七藥材進(jìn)行了提取工藝研究。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Waters 2695/2996型高效液相色譜儀(美國Waters有限公司)。所有藥材均購自廣州致信中藥飲片有限公司;人參皂苷Rb1、人參皂苷 Rg1、三七皂苷R1對照品(批號分別為110704－200318，110706－200319，110736－200321，含量測定用)均購自中國藥品生物制品檢定所;乙腈、甲醇為色譜純;其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[3－4]

色譜柱:Kromasil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈－水，梯度洗脫，0～9 min，乙腈20%→35%，水80%→65%;流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:15 μL;柱溫:30℃;檢測波長:203 nm。理論板數(shù)按三七皂苷R1峰計(jì)算是4 000。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 溶液制備

精密吸取各樣品溶液5 mL，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓ㄈ葜?5 mL量瓶中，作為供試品溶液。因以甲醇為溶劑溶解三七的提取物，故以甲醇為陰性對照溶液。

精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1對照品適量，加甲醇制成每1 mL分別含人參皂苷Rg11.024 mg、人參皂苷Rb11.004 mg、三七皂苷R10.503 mg的混合溶液，作為對照品溶液。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別精密吸取對照品溶液 5，10，20，25，30 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積積分值為縱坐標(biāo)計(jì)算回歸方程。結(jié)果見表1。

表1 含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果

2.1.4 含量測定方法

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各15 μL，注入液相色譜儀中，按2.1.1項(xiàng)下條件測定人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1峰面積，計(jì)算三七總皂苷(PNS)的含量。

2.2 提取工藝優(yōu)選

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)處方中藥物的性質(zhì)、處方的功能主治以及藥物中活性成分的理化性質(zhì)，以PNS提取效率為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)，對影響提取效率的乙醇體積分?jǐn)?shù)(因素A)、乙醇用量(因素B)、提取時(shí)間(因素C)、提取次數(shù)(因素D)進(jìn)行考察。因素水平見表2。精密稱取三七粗粉25 g，按試驗(yàn)列號各條件分別回流提取，濾過，合并濾液，各定容至500 mL，作為樣品溶液。精密吸取各樣品溶液5 mL水浴蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓ㄈ葜?5 mL量瓶中，作為供試品溶液。按照2.1.1項(xiàng)下條件測定PNS含量。結(jié)果見表3及表4。

表2 因素水平表

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析表

2.2.2 結(jié)果分析

由直觀分析可知，較優(yōu)的提取工藝是A2B3C3D3。由方差分析結(jié)果可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、提取次數(shù)對提取效果有顯著性影響，提取時(shí)間無顯著影響，所以取水平數(shù)0.5 h即可。比較各因素的極差值可以看出，影響提取效果的因素順序?yàn)镈＞A＞B。綜合分析結(jié)果，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、用量為8倍量，提取3次，每次0.5 h。因此，確定藥材較優(yōu)的提取工藝條件為A2B3C1D3。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取藥材，按較優(yōu)工藝A2B3C1D3提取，并測定含量。經(jīng)驗(yàn)證，此工藝能提取出的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1的總含量約是87.39 mg/g，轉(zhuǎn)移率達(dá)95.3%，表明此提取工藝合理可行、穩(wěn)定。

3 討論

提取工藝的評價(jià)指標(biāo)應(yīng)是提取有效成分質(zhì)和量的代表，也是提取物臨床作用性質(zhì)和強(qiáng)度的代表。對于有效成分或有效部位明確的藥材來說，評價(jià)指標(biāo)較好選擇，有效成分可直接測其量，有效部位中的主要有效成分也與療效有直接量效關(guān)系。三七是貴重藥材，若以全粉末形式給藥，對黏膜會產(chǎn)生一定的刺激，藥物會有所流失，降低藥效，因此必須對三七進(jìn)行提取。三七中藥理活性成分的研究主要集中在三七皂苷成分和氨基酸，此類成分溶于甲醇、乙醇和水。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，以水和乙醇為提取溶劑，測定提取液中三七總皂苷含量，比較提取溶劑對三七總皂苷提取效率的影響，結(jié)果以水為溶劑提取三七總皂苷的量僅占70%乙醇提取的54.1%，表明以乙醇回流提取三七是合理可行的，確定了三七醇提的合理性。

[1]袁繼偉，李晶堯，焦躍軍.中藥三七對血液系統(tǒng)的藥理藥效研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)療前沿，2009，4(19):13.

[2]鄭茵紅，高瑞蘭，朱大元，等.三七總皂苷及其單體對人骨髓造血祖細(xì)胞增殖作用的研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2003，10(3):135－137.

[3]吳杏梅.正交試驗(yàn)法優(yōu)選紅藥片提取工藝研究[J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2007，2(33):37－39.

[4]張述耀.正交試驗(yàn)法優(yōu)選復(fù)方三七活血顆粒中藥材的提取工藝研究[J].國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)，2009，15(13):99－101.

Study on Extraction Process of Radix Notojinseng in Sanqi Zhixue Patchs by Orthogonal Design

Yao Shaoyi1， Ye Maoqing2， Zhang Chaolin3， Liao Huawei4
(1.Affiliated Boji Hospital，Sun Yat－sen University，Guangzhou，Guangdong，China 511300; 2.People's Hospital of Sihui City，Sihui，Guangdong，China 526200;3.Shenzhen Wanhe Pharmaceutical Co.，Ltd.，Shenzhen，Guangdong，China 518057; 4.School of TCM，Guangdong Pharmaceutical College，Guangzhou，Guangdong，China 510006)

Objective To optimize the extraction technology of medicinal material radix notojinseng in Sanqi Zhixue Patchs.Methods The orthogonal test was employed for selecting the optimum extraction technology with the total contents of ginsenoside Rg1，ginsenoside Rb1，notoginsenoside R1as the indexes in water extraction.Results The better extraction technology was adding 8 times amount of 70% ethanol，extracting for 3 times and 0.5 h for each time.Conclusion The considerable extraction rate of active components in the drugs is achieved by applying the selected technology，and the simple method is fit for production.

Sanqi Zhixue Patchs;orthogonal design;ginsenoside Rg1;ginsenoside Rb1;notoginsenoside R1

TQ461;R284.2

A

1006－4931(2011)04－0046－03

2010－08－09)

姚少毅(1980－)，男，本科，藥師，研究方向?yàn)榕R床藥學(xué)，(電子信箱)ysy08@126.com;廖華衛(wèi)(1972－)，男，高級實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹兴幩巹┘爸兴幓瘜W(xué)，本文通訊作者，(電子信箱)120303812@qq.com。