葡萄糖和胰島素對4T1腫瘤細胞分泌VEGF的影響

孫鳳娥 王蕾 周慧敏

近年來，糖尿病患者惡性腫瘤發生率明顯增加。大量研究顯示，糖尿病與乳腺癌的發生發展密切相關［1］。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在抑制腫瘤免疫、促進腫瘤血管形成中發揮重要作用，對惡性腫瘤的發生發展及預后具有重要意義［2］。目前有關葡萄糖和胰島素對4T1腫瘤細胞分泌VEGF的影響，筆者尚未見相關研究報道。本實驗體外檢測不同濃度的葡萄糖和胰島素對4T1腫瘤細胞VEGF分泌的影響，為分析糖尿病與乳腺癌發生、發展的關系提供實驗和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗用腫瘤細胞株為小鼠乳腺癌細胞株(4T1腫瘤細胞，河北醫科大學免疫學教研室凍存);RPMI 1640細胞培養基為海克隆生物制品有限公司產品;胎牛血清為ExCell Biology，Inc.產品;胰島素為江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司產品;葡萄糖、青霉素、鏈霉素均為華北制藥有限公司產品;小鼠VEGF酶聯免疫試劑盒為美國R＆D公司產品。

1.2 4T1腫瘤細胞的培養 4T1腫瘤細胞復蘇后，接種于RPMI 1640培養基(其中含10%的胎牛血清，100 U/ml的青霉素，100 μg/ml的鏈霉素)中，置于 37℃、5%CO2的培養箱培養，約24～48 h換液1次，當細胞生長至90%以上時進行傳代。

1.3 實驗分組 取對數生長期的4T1腫瘤細胞進行分組實驗。根據培養液加入葡萄糖和胰島素濃度的不同，將實驗所用細胞分為15組:A組(對照組)只加RPMI 1640培養液(不含葡萄糖和胰島素);B組RPMI 1640培養液+5mmol/L葡萄糖;C組RPMI 1640培養液+10 mmol/L葡萄糖;D組RPMI 1640培養液+25 mmol/L葡萄糖;E組RPMI 1640培養液+35 mmol/L葡萄糖;F組RPMI 1640培養液+5μU/ml胰島素;G組RPMI 1640培養液 +25μU/ml胰島素;H組 RPMI 1640培養液 +125 μU/ml胰島素;I組 RPMI 1640 培養液 +250 μU/ml胰島素;J組RPMI 1640培養液 +1.25 μU/ml胰島素;K 組 RPMI 1640培養液+5 mmol/L葡萄糖+5 μU/ml胰島素;L組RPMI 1640培養液+5 mmol/L葡萄糖+125 μU/ml胰島素;M組RPMI 1640培養液+25 mmol/L葡萄糖+125 μU/ml胰島素;N組RPMI 1640培養液+25 mmol/L葡萄糖+5 μU/ml胰島素;O組RPMI 1640培養液 +25 mmol/L葡萄糖 +1.25 μU/ml胰島素。

1.4 實驗各組4T1細胞培養上清的制備 將對數生長期的4T1細胞接種于6孔細胞培養板中，濃度為2×105/ml，15個實驗組每組均設雙復孔，每孔培養液均為3 ml，置于37℃，5%CO2的培養箱培養。48 h后收集細胞培養上清，離心3000 r/min 20 min，－20℃保存。

1.5 ELISA法檢測4T1細胞培養上清中VEGF的含量 采用雙抗體夾心法。嚴格按小鼠VEGF定量檢測試劑盒(ELISA)說明書操作。通過繪制標準曲線，計算樣品中VEGF的濃度。

1.6 統計學分析應用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以表示，進行單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度的葡萄糖對4T1細胞分泌VEGF的影響 含有不同濃度葡萄糖的B、C、D、E組細胞培養上清中VEGF的濃度［分別為(123±13)pg/ml、(127 ±12)pg/ml、(129 ±13)pg/ml、(125±10)pg/ml］與 A組［(115±7)pg/ml］比較差異均無統計學意義(P ＞0.05)。

2.2 不同濃度的胰島素對4T1細胞分泌VEGF的影響 F組、G組和J組細胞培養上清中VEGF的濃度［分別為(125±12)pg/ml、(130 ±10)pg/ml］和［(128 ±11)pg/ml］與 A 組比較均無統計學意義(P＞0.05);但是隨著胰島素濃度的變化，含有高濃度胰島素的 H組、I組(培養液分別含有125 μU/ml、250 μU/ml的胰島素)細胞培養上清中VEGF的濃度［分別為(151±9)pg/ml、(153±11)pg/ml］與 A組比較均有統計學意義(P＜0.05)，但H組和I組之間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.3 不同濃度的葡萄糖和胰島素同時作用對4T1細胞分泌VEGF的影響 L組和M組細胞培養上清中VEGF的濃度［分別為(151±11)pg/ml和(150±14)pg/ml］與A組比較差異有統計學意義(P＜0.05);而K組、N組和O組細胞培養上清中VEGF的濃度［分別為(126±14)pg/ml、(130±17)pg/ml和(130±15)pg/ml］與A組比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。

3 討論

在2型糖尿病病程中，經常存在不同程度的胰島素抵抗和高胰島素血癥。以往的研究顯示，胰島素在高濃度時能引起兔視網膜Muller細胞VEGF分泌增加及其mRNA表達增加［3］;對糖尿病大鼠進行胰島素治療，發現胰島素可導致VEGF mRNA表達量和VEGF含量增加［4］;而應用胰島素治療糖尿病患者也有類似發現［5］。有學者應用胰島素作用于結直腸癌腫瘤細胞，顯示胰島素能促進腫瘤細胞分泌VEGF［6］。本實驗結果與以往這些研究結果相似。國外學者通過對胰腺癌的研究提出，高濃度胰島素上調腫瘤細胞VEGF mRNA的表達、增加VEGF分泌的機制是通過結合IGF-I受體所致［7］。胰島素和IGF-1與彼此受體間存在交叉結合現象［8］，胰島素在高濃度時既能與胰島素受體結合，也能與IGF-I受體結合。

VEGF可由某些腫瘤細胞、腫瘤間質細胞和單核巨噬細胞產生。一方面，VEGF可直接刺激血管內皮細胞增殖，形成新生血管［9］，有利于腫瘤的生長、浸潤和轉移;另一方面，VEGF可通過發揮免疫抑制作用，促進腫瘤的發生發展:(1)抑制樹突狀細胞(DC)的分化、成熟及抗原提呈功能［10］;(2)抑制細胞毒T細胞(CTL)特異性殺傷靶細胞的功能;(3)抑制凋亡因子的表達，阻止腫瘤細胞凋亡［11］。

有資料顯示，乳腺癌組織中VEGF的表達水平與腫瘤組織的微血管密度呈正相關，與乳腺癌轉移、復發、生存率明顯相關［12］，表明VEGF對乳腺癌的發生發展及預后具有重要作用。因此，對于糖尿病患者以及糖尿病伴有乳腺癌的患者，應控制胰島素抵抗和高胰島素血癥，減少VEGF的分泌，以阻止乳腺癌的發生發展及轉移。

1 Jordan S，Lim L，Vilainerun D，et al.Breast cancer in the Thai Cohort Study:An exploratory case-control analysis.Breast，2009，18:299-303.

2 韓文峰，魏素菊.VEGF-A在腫瘤中的研究進展.河北醫藥，2010，32:214-216.

3 Song E，Wang YH，Xu Q，et al.Effects of high concentrations insulin on VEGF expression in cultured Muller cells.Zhonghua Yan Ke Za Zhi，2004，40:40-44.

4 Kobayashi T，Kamata K.Short-term insulin treatment and aortic expressions of IGF-1 receptor and VEGF mRNA in diabetic rats.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，283:H1761-1768.

5 Poulaki V，Qin W，Joussen AM，et al.Acute intensive insulin therapy exacerbates diabetic blood-retinal barrier breakdown via hypoxia-inducible factor-1alpha and VEGF.J Clin Invest，2002，109:805-815.

6 周慧敏，劉鳳娟，張素敏，等.葡萄糖、胰島素對Colon26腫瘤細胞分泌VEGF的影響.第四軍醫大學學報，2009，30:2119-2121.

7 Zeng H，Datta K，Neid M，et al.Requirement of different signaling pathways mediated by insulin-like growth factor-I receptor for proliferation，invasion，and VPF/VEGF expression in a pancreatic carcinoma cell line.Biochem Biophys Res Commun，2003，302:46-55.

8 Lawrence MC，McKern NM，Ward CW.Insulin receptor structure and its implications for the IGF-1 receptor.Curr Opin Struct Biol，2007，17:699-705.

9 Sato Y，Abe M，Tanaka K，et al.Signal transduction and transcriptional regulation of angiogenesis.Adv Exp Med Biol，2000，476:109-115.

10 Ohm JE，Carbone DP.VEGF as a mediator of tumor-associated-immuno-deficiency.Immunol Res，2001，23:263-272.

11 Beierle EA，Strande LF，Chen MK.VEGF upregulates Bcl-2 expression and is associated with decreased apoptosis in neuroblastoma cells.J Pediatr Surg，2002，37:467-471.

12 李宏江，敬靜，汪靜，等.乳腺癌血管內皮生長因子與微血管密度的分布及與預后的關系.腫瘤學雜志，2002，8:215-217.