代謝組學技術在藥物安全性研究中的應用

方 舟,方 芳,孫長海

(1.佳木斯大學藥學院,黑龍江佳木斯 154007;2.佳木斯大學第一附屬醫院藥劑科,黑龍江佳木斯 154003)

經典的對藥物等化合物的安全性評價,是通過給予一定數量的實驗動物大劑量的待測化合物,觀察其毒性效應特征,然后將其實驗結果外推到接受小劑量相同化合物的大量人群。它是一項涉及多學科的綜合性的毒理學評價過程。然而,這些評價手段還存在著許多缺點,比如實驗動物和人對藥物反應存在種屬差異;動物使用劑量與人體實際接觸劑量的差異;動物數量有限,難以發現發生率低的毒性反應等;此外還有實驗周期長及費用昂貴等問題[1]。因此,研究篩選靈敏度高、特異性強和實驗周期短的藥物安全評價方法是毒理學科研工作者十分關心的重大課題。

與經典方法相比,代謝組學能更快、更準確地發現毒性物質及其毒性規律,尤其對于多靶點的綜合性毒性反應,代謝組學可從多個角度進行全面評價,故有利于藥物的研發和藥物安全性方面的研究。

代謝組學是20世紀90年代初興起的一門對細胞、組織或器官以及整個生物體系所有小分子代謝產物進行定性、定量分析的新技術。它采用核磁共振(NM R)或質譜(MS)技術為主要檢測手段,將測量得到的生物體液、組織的代謝數據與化學計量學聯系起來,建立復雜生物體系的代謝譜圖,與基因組學、轉錄組學、蛋白質組學一起揭示生命運動的本質和規律。近年來,代謝組學已經廣泛應用于毒理學和藥理學(如藥物安全性評價、生物標志物的鑒別及毒性的分類和篩選等)、功能基因組學(如鑒別和確證動物模型)、疾病診斷、環境毒理學等。本文僅就代謝組學在藥物安全性評價方面的應用作初步論述。

1 代謝組學概況

1999年,Nicholson小組[2]基于對生物體和細胞內小分子代謝產物的多年研究提出了“代謝組學”的概念。代謝組學是效仿基因組學和蛋白質組學的研究思想,對生物體內所有代謝物進行定量分析,并尋找代謝物與生理病理變化的相對關系的研究方式,是系統生物學的組成部分。其研究對象大都是相對分子質量1000以內的小分子物質。先進分析檢測技術結合模式識別和專家系統等計算分析方法是代謝組學研究的基本方法。

代謝組學的分析方法多種多樣,以核磁共振波譜法和色譜-質譜聯用法為主[3]。核磁共振波譜法包括核磁共振氫譜法,核磁共振碳譜法,核磁共振磷譜法,色譜-質譜連用法包括GC-MS和 HPLC-MS。

藥物代謝產物是在藥物代謝酶的作用下生成的最終產物,通過對機體代謝產物的深入研究,可以判斷機體是否處于正常狀態,而對基因和蛋白質的研究都無法得出這樣的結論。目前,已經研究清楚的普通代謝途徑包括三羧酸循環(TCA),糖酵解,花生四烯酸(AA)/炎癥途徑。

在代謝組學的研究中,如果試驗中發現樣本中三羧循環底物異常時,則提示可能與機體能量代謝途徑的紊亂相關,同時三羧循環氧化酶系均存在與細胞的線粒體中,因此,三羧循環的紊亂可能預示著線粒體的紊亂。在代謝組學的研究中,三羧循環的紊亂是被檢測到頻率最高的代謝通路之一。

有研究表明[4],尿液中牛磺酸含量的變化是檢測肝臟損傷的重要指標。檸檬酸、2-酮戊二酸是三羧酸循環的中間產物,其變化與肝臟能量代謝相關,可反映肝臟線粒體的功能[4,5]。

代謝組學研究的技術平臺包括以下幾個部分:樣品的收集、生物反應的淬滅、樣品預處理、儀器分析與鑒定、數據分析和標志物生物學意義解讀以及機體生化反應機制和生命現象的認知。其中,代謝產物的檢測、分析與鑒定是代謝組學技術的核心部分,它主要利用LC-MS、GC-MS以及NM R等各種高通量、高分辨、高靈敏度的譜學技術對樣品進行分離分析 。但由于各種技術均有其各自的優缺點和適用范圍,且內源性化合物具有理化性質多樣性、濃度范圍變化大等特點,故需采用各種技術聯用和方法整合的策略,保證盡可能精確地分析生物體系中盡量多的代謝組分,使整個分析過程盡可能多地保留樣品中代謝物的整體信息。利用譜學技術分析獲得的代謝指紋圖譜,經過現代化學計量學和生物統計學領域的新方法對其進行降維和信息挖掘得到可用于代謝組學研究的格式。

2 相關研究與應用

將代謝組學用于藥物毒性和安全性的評價已成為目前新藥開發過程中一項倍受關注的研究課題,國外不少政府部門和單位已經組建了相關機構和組織專門從事此項工作,如21世紀初,英國倫敦大學帝國理工學院與6家醫藥公司聯合成立了一個研究組織—Consortium for Metabonomic Toxicology(COMET),其主要研究目標是建立可用NM R從尿液和血漿樣本中獲得代謝數據,以用于候選藥物臨床前的毒性測試的一整套毒理代謝組學研究體系和通用的標準評價方法。如今,該組織已分析了多種對肝臟和腎臟具有毒性的模型毒物,測定了它們在尿液和血清(包括生物組織)中的代謝數據,并已計劃據此建立一個含有大量模型毒物信息的數據庫,進而開發能對更多模型藥物進行分析的專家系統,以對候選藥物的肝臟和腎臟毒性進行毒理學篩選,從而降低新藥的創新成本,縮短研發周期[6]。

此外,在對已有藥物,尤其是中藥的安全性評價方面,代謝組學技術也發揮了它的作用,如美國食品和藥品管理局(FDA)啟動了開展植物藥安全性和藥物毒性評價的代謝組學研究計劃;荷蘭還專門成立了針對中藥的代謝組學研究中心,對藥物的安全性進行評價。近年來,在劉昌孝等院士的倡導下[7]國內也已開展了一些對藥物安全性評價的代謝組學的研究。

廖艷[8]等基于核磁共振氫譜法對異煙肼肝毒性的代謝組學特征進行了研究,將大鼠連續經口灌胃 0、50、100、200和400mg/kg異煙肼,3、7、14d收集給藥前 24h及給藥期間每天24h的尿液,測定質子核磁共振譜,并進行血漿生化指標測定和肝臟組織學檢查。結果常規毒性研究方法顯示異煙肼在較高劑量、較長給藥時間(7d以上)時表現出肝毒性,并且有較好的時間-效應關系。對大鼠尿液進行代謝組學研究顯示各組動物代謝譜各不相同,隨著給藥時間的變化大鼠尿液NMR譜發生一定改變,代謝譜的改變與常規毒性檢測指標相符且更靈敏。與正常對照組比較給藥組尿樣NM R譜葡萄糖和牛磺酸顯著增加,2-酮戊二酸和檸檬酸顯著降低。大鼠尿液NM R代謝軌跡與異煙肼毒性作用時間密切相關,異煙肼引起的肝毒性與線粒體功能受損、三羧酸循環中能量代謝異常及葡萄糖代謝紊亂有關。

廖艷等[9]還按照同樣方法研究利福平肝毒性時效關系,將大鼠隨機分成兩組和1個空白組,使用兩個不同濃度給藥,結果各組大鼠尿液的代謝譜各不相同,隨著時間的推移,大鼠尿液NMR譜發生一定改變,尿樣NMR譜葡萄糖和牛磺酸顯著增加,2-酮戊二酸和檸檬酸顯著降低。同樣大鼠尿液NM R代謝軌跡與利福平作用時間密切相關,利福平引起的肝毒性與三羧酸循環中能量代謝異常及葡萄糖代謝紊亂有關。

劉霞[10]等基于NM R代謝組學方法分析馬兜鈴酸I(AA-I)誘導的雌雄小鼠急性腎毒性,分析了小鼠尿樣的代謝特征,揭示出馬兜鈴酸I(AA-I)導致急性腎毒性的分子機理及其在雌性和雄性小鼠上差異的根源。研究結果表明,AA-I的急性腎毒性主要來自AA-I給藥后抑制了體內的三羧酸(TCA)循環和能量代謝,破壞了體內腸道菌群的生態平衡,改變了腎臟細胞內外的滲透壓,從而引起了腎小管的損傷。代謝模式分析顯示雄性小鼠對AA-I的腎毒性比雌性小鼠更敏感,可能源于雄性小鼠本身更低的能量代謝。

Chan等[11]采用高效液相色譜飛行時間質譜聯(HPLC/TOF-MS)方法研究了服用馬兜鈴酸后大鼠尿液的代謝圖譜,發現犬尿烯酸和馬尿酸為反映藥物毒性的生物標志物,可用作評價馬兜鈴酸毒性的生物學指標。

梁琦[12]等人進行基于核磁共振氫譜法的廣防己的腎毒性代謝組學研究,他們選擇大鼠為實驗動物,收集尿液,將大鼠隨機分為兩組,1個正常對照組,1個給藥組,灌胃給藥。他們發現馬尿酸鹽、肌酐、TM AO在尿液中的含量有上升階段,這表現腎臟損傷能增加腎臟的濾過作用。他們還發現大鼠尿液中的牛磺酸的含量上升,檸檬酸的含量下降,2-酮戊二酸的含量下降,認為廣防己還能引起肝毒性。他們還進行血清生化分析和腎臟病理學觀察。

趙劍宇[13]等采用基于NM R的代謝組學方法研究了大鼠經關木通染毒后,尿液的代謝表型改變及其與組織病理及尿液、血漿生化指標的相關性:實驗大鼠被分別灌胃給予不同劑量的關木通,每天 1次,連續6d;最后,服用關木通各劑量組大鼠腎臟出現不同程度的炎癥壞死,尿樣中氧化三甲胺、枸櫞酸、牛磺酸、肌酐、甜菜堿等內源性代謝物水平均有不同程度的下降,而醋酸、丙氨酸水平則顯著上升;分析表明,空白對照組與關木通組的代謝譜有明顯差異,而造成組間差異的主要是醋酸和氧化三甲胺的變化,在不同劑量條件下,關木通各組大鼠的代謝譜也各不相同,而此與腎臟病理和血漿生化改變相一致。

李建新等[14]采用基于NM R的代謝組學方法研究了雷公藤甲素的腎臟毒性,發現尿樣中甜菜堿、二甲基甘氨酸為反映藥物對腎乳頭毒性的生物標志物;內源性化合物醋酸鹽、乳酸、甘氨酸為反映藥物對腎臟皮層S1段毒性的生物標志物;丙酮為反映藥物對腎臟皮層S3段毒性的生物標志物。其中以醋酸鹽、甜菜堿和丙酮含量升高最為顯著。這些代謝物的變化說明大鼠尿液代謝組學分析能夠較好地反映雷公藤甲素的腎毒性特征,并能對毒性作出早期預測。

樊夏雷等[15]人應用GC/MS及模式識別技術為核心的代謝組學方法對大鼠尿樣及血漿樣品進行研究,結果表明,給藥后2d和4d,血漿中代謝組水平、大鼠尿液與給藥前產生明顯變化,內源性代謝產物譜隨時間動態變化明顯,能夠明顯區分出各天的變化趨勢,表征出毒性發生,發展的動態過程。得出結論是關木通能夠對腎臟造成損害。應用基于GC-MS的代謝組學方法,初步獲得關木通致腎臟損害的“代謝產物譜”,根據不同的代謝表型能夠區分出關木通的毒性作用。大鼠尿液、血漿中的代謝產物譜與關木通毒性作用的經時過程密切相關,能夠很好區分出機體的不同中毒狀態。

3 結語

代謝組學技術為藥物安全性研究提供了新的思路與方法,在藥物安全性研究中已取得了一定的成果,但仍有些不足,目前代謝組學在理論和技術上還有很多問題有待解決,例如分析檢測技術和數據處理技術還有待提高,得出數據的可靠性還未得到確證等,這在一定程度上限制了代謝組學在藥物安全性評價中的進一步應用。藥物安全性歷來是臨床應用中倍受關注的問題,特別中藥安全性問題是中藥國際化的主要障礙之一。由于中藥種植的生態環境、炮制方法、配伍應用、體內生物轉化產物、生物活性和臨床應用均存在多樣性的特點,故很難逐一搞清其中的哪一種化學成分產生的毒副作用,而代謝組學因其高通量及靈敏度和特異性上的優勢將會成為闡明某些中藥毒性及安全性的有效方法和途徑之一。將能反映整體觀的代謝組學用于對中草藥毒性的研究,對于確保中藥用藥的合理性和安全性,建立現代中藥的藥理、毒理評價體系,指導臨床擬訂合理的臨床用藥方案、劑量和時間均有理論意義和實用價值[7],且對我國當前的中藥安全性研究起到推動作用。相信隨著科學技術的發展,各種組學數據的成功對接,代謝組學、基因組學、轉錄組學、蛋白質組學等系統生物學的方法必將對藥物的安全性方面的研究產生推動作用。

[1]Johnson DE,Wolfgang GH.Assessing the potential toxicity ofnew pharmaceutics[J].Current Topics Med Chem,2001,1:233-245

[2]Nicholson JK,Lindon JC,Holmes E.Metabonomics:understanding the metabolic responses of living sy stems to pathophysiological stimuli viamultivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J].Xenobiotica,1999,29(11):1181-1189

[3]陳慧梅,劉志紅.代謝組學及其研究方法和應用[J].腎臟病與腎透析移植雜志,2005,14(1):59-63

[4]Jaeschke H,Go res GJ,Cederbaum AI,et al.Mechanisms of hepatotoxi2city[J].T oxicol Sci,2002,65(2):166-176

[5]廖艷,彭雙清,顏賢忠,等.抗結核藥物異煙肼肝毒性時效關系的代謝組學[J].中國醫學科學學報,2007,29(6):730-737

[6]Ebbe ls T,Keun H,Beckonert O,et al.T oxicity c lassification from m etabonom ic data using a density superposition approach“CLO UDS ”[J].Anal Chim Acta,2003,490(1/2):109-122

[7]劉昌孝.代謝組學的發展與藥物研究開發[J].天津藥學,2005,17(2):1-6

[8]廖艷,彭雙清,顏賢忠,等.異煙肼肝毒性的代謝組學特征研究[J].中國新藥雜志,2007,16(4):288-292

[9]廖艷,彭雙清,顏賢忠,等.利福平致肝臟毒性的代謝組學特征研究[J].中國新藥雜志,2007,16(16):1260-1265

[10]劉霞,肖瑛,高紅昌,等.基于1H NM R代謝組學方法分析馬兜鈴酸I誘導的雌雄小鼠急性腎毒性[J].高等化學學校學報,2010,5,31:927-932

[11]ChanW,Ca i Z W.Ar isto lochic acid induced changes in the m etabo lic pro file o f rat ur ine[J].J Pharm Biomed Anal,2008,46(4):757-762

[12]梁琦,倪誠,謝鳴,等.廣防己的腎毒性代謝組學研究[J].中西醫結合學報,2009,87(8):746-752

[13]趙劍宇,顏賢忠,彭雙清.關木通的腎毒性代謝組學研究[J].中草藥,2006,37(5):233-241

[14]李建新,華嘉,何翠翠.中藥毒性的代謝組學研究(#):雷公藤甲素的腎臟毒性[J].亞太傳統醫藥,2007,3(7):41-45

[15]樊夏雷,劉文英,王廣基,等.基于GCPTOFPMS的關木通腎毒性代謝組學研究[J].毒理學雜志,2007,21(4):323